權(quán)利要求書： 1.一種多肽介導(dǎo)的仿生二氧化硅納米粒子的制備方法，其特征在于：包括如下步驟：步驟1：采用ITC純化法制備高純度的類彈性蛋白多肽ELPs；ITC純化法具體包括：首先對(duì)ELPs溶液加熱使之發(fā)生相變，在高于Tt條件下離心去收集沉淀；接著，用預(yù)冷的緩沖液溶解沉淀，在低溫條件下離心，對(duì)離心后的沉淀進(jìn)行復(fù)性處理，收集上清，此即為純化的類彈性蛋白多肽ELPs；

步驟2：類彈性蛋白多肽ELPs介導(dǎo)二氧化硅粒子沉淀，獲得仿生二氧化硅納米粒子；具體包括如下過程：

將步驟1得到的類彈性蛋白多肽ELPs溶解于PBS緩沖液得到ELPs溶液，類彈性蛋白多肽ELPs的濃度范圍為10μmol/L?100μmol/L，pH=6.9?7.1；

由SiO2前體溶解于溶液中配制硅源溶液，SiO2前體是四甲基硅烷或者四乙基硅烷；

將體積為a的ELPs溶液與體積為b的硅源溶液混合，a：b=（9?11）：1；

混合均勻后在室溫下靜置預(yù)設(shè)時(shí)間，高速離心收集二氧化硅沉淀，即得到仿生二氧化硅納米粒子。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的仿生二氧化硅納米粒子的制備方法，其特征在于：硅源溶液配制過程如下：

配制初始硅源溶液：將質(zhì)量為c的SiO2前體溶于濃度為d的鹽酸中，定容v即可獲得初始硅源溶液；c單位為克，d單位為mmol/L，v單位為mL；

配制離散石墨溶液：將質(zhì)量為e的石墨溶于濃度為d的鹽酸中，其中，c>5e，定容v，然后進(jìn)行超聲共混獲得離散石墨溶液；e單位為克；

然后將初始硅源溶液和離散石墨溶液混合并高速攪拌預(yù)設(shè)時(shí)間，即可得到混合后的硅源溶液。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的仿生二氧化硅納米粒子的制備方法，其特征在于：其中混合后的硅源溶液通過如下過程獲得：將石墨加入鹽酸，進(jìn)行超聲攪拌預(yù)設(shè)時(shí)間，得到懸濁液，然后將懸濁液和初始硅源溶液快速混合，在35?60℃進(jìn)行攪拌預(yù)設(shè)時(shí)間，即可得到混合后的硅源溶液。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的仿生二氧化硅納米粒子的制備方法，其特征在于：得到的仿生二氧化硅納米粒子的尺寸為70nm至400nm，仿生二氧化硅納米粒子中二氧化硅的質(zhì)量百分比為10%?99%。

5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的仿生二氧化硅納米粒子的制備方法，其特征在于：石墨的質(zhì)量?3

百分比濃度ω范圍為3wt%?3.7wt%，ω=質(zhì)量e*10 /12*v。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的仿生二氧化硅納米粒子的制備方法，其特征在于：步驟1得到的類彈性蛋白多肽ELPs的基因序列為ELP[K8F?s]，ELP[K8F?s]即指連續(xù)的10個(gè)PGXG五肽單元中，每個(gè)五肽的第4位Xaa有1個(gè)賴氨酸（K）、8個(gè)纈氨酸（）、1個(gè)苯丙氨酸（F），s即指有s個(gè)以PGXG為單元的重復(fù)序列，s的取值為10?300。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的仿生二氧化硅納米粒子的制備方法，其特征在于：步驟1中，對(duì)離心后的沉淀進(jìn)行復(fù)性處理具體包括：首先對(duì)沉淀在溫度?18℃至0℃范圍內(nèi)進(jìn)行快速脫水處理，并對(duì)脫水處理后的沉淀進(jìn)行適度震碎，獲得固態(tài)顆粒物，然后對(duì)該固態(tài)顆粒物進(jìn)行過篩、風(fēng)選或者高壓靜電吸附，將大部分包涵體去除，獲得復(fù)性后的沉淀。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的仿生二氧化硅納米粒子的制備方法，其特征在于：所述復(fù)性處理還包括：將復(fù)性后的沉淀在低溫下折疊復(fù)性以減少蛋白質(zhì)聚集的形成，當(dāng)形成聚集體的中間體已經(jīng)減少時(shí)，迅速將溫度提高10度，以促進(jìn)蛋白質(zhì)折疊復(fù)性，從而可獲得高復(fù)性效率的固態(tài)顆粒；低溫是指?18℃至?10℃。

9.一種由權(quán)利要求1?8任一制備方法得到的仿生二氧化硅納米粒子的應(yīng)用，所述仿生二氧化硅納米粒子用于酶的自固定化。

10.權(quán)利要求1?8任一制備方法得到的仿生二氧化硅納米粒子在制備緩釋藥物載體中的應(yīng)用。

說明書： 一種多肽介導(dǎo)的仿生二氧化硅納米粒子的制備方法及應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域[0001] 本發(fā)明涉及借助生物的方法人工合成特定納米結(jié)構(gòu)的無機(jī)材料，具體是一種仿生二氧化硅納米粒子的制備，尤其是基于多肽介導(dǎo)的仿生二氧化硅納米粒子的制備方法。

背景技術(shù)[0002] 在自然界中存在著一種很普遍的現(xiàn)象——生物礦化。在生物礦化現(xiàn)象中，二氧化硅占了較大一部分，其廣泛存在于如海綿、細(xì)菌、單細(xì)胞藻類、高等植物和原生動(dòng)物中等等。

科學(xué)家經(jīng)深入的研究發(fā)現(xiàn)，相較于人工合成技術(shù)所產(chǎn)生的二氧化硅，這些生物二氧化硅具

有前者所難以實(shí)現(xiàn)的特定功能和復(fù)雜的結(jié)構(gòu)。除此之外，該種生物礦化過程屬于非常典型

的綠色低耗能合成技術(shù)，因其在相對(duì)溫和的條件下形成，不需要傳統(tǒng)合成技術(shù)的高溫、高壓

和極端pH值等較為苛刻的合成條件。

[0003] 生物礦化的另一個(gè)重要特征是：有機(jī)物可以以自組裝有機(jī)聚合體或是使用生物大分子模板來合成如納米級(jí)別精細(xì)的結(jié)構(gòu)的有機(jī)、無機(jī)復(fù)合材料，科學(xué)家可遵循該特征來合

成具有功能多樣和形態(tài)復(fù)合的無機(jī)材料。因此，該類研究方向在材料化學(xué)研究領(lǐng)域中也占

據(jù)了重要的一部分，以合成高分子有機(jī)物為模板或是模擬生物分子引導(dǎo)無機(jī)材料(例如二

氧化硅)至新結(jié)構(gòu)來制造有機(jī)分子涂層或合成納米材料，該種方式在仿生領(lǐng)域等方面有著

優(yōu)異的應(yīng)用前景。

[0004] 生物礦化過程中，生物大分子(生物體含有一些具有特殊功能或結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)等有機(jī)大分子)功能性基團(tuán)的界面處會(huì)發(fā)生一些功能性的有機(jī)大分子和無機(jī)物離子之間的相

互作用，即生物礦物為何具有特殊的組裝方式和異常的精細(xì)結(jié)構(gòu)，是因該類功能性大分子

借助自身的功能基團(tuán)從納米尺度上對(duì)無機(jī)礦物的結(jié)構(gòu)和形態(tài)進(jìn)行了調(diào)控，也就是說，蛋白

質(zhì)等有機(jī)物質(zhì)在生物礦化過程中起到了相當(dāng)重要的調(diào)控作用。

[0005] 受自然界中海洋真核生物硅藻類和海綿體的硅礦化過程，現(xiàn)有技術(shù)中采用從生物體提取的活性分子(如silaffins)、合成的胺類分子或大分子、多肽以及蛋白質(zhì)，合成仿生

二氧化硅，例如申請(qǐng)?zhí)枮?00610124462.X的功能性仿生二氧化硅納米粒子及其制備方法，

其采用陽離子聚胺微凝膠作為功能性模板，使二氧化硅在環(huán)境條件下原位仿生沉積，得到

陽離子聚胺/SiO2雜化的功能性納米粒子。其中，其使用的功能性模板無法被反復(fù)使用，因

此該二氧化硅納米粒子的制備過程較為復(fù)雜，增加了其實(shí)現(xiàn)成本。

[0006] 為此，現(xiàn)有技術(shù)此基礎(chǔ)上研究出了一種類彈性蛋白多肽(ELPs)來替代現(xiàn)有的功能性模版，該類彈性蛋白多肽是一類由al?Pro?Gly?Xaa?Gly(PGXG)五肽重復(fù)單元序列串聯(lián)

組成的人工聚合物，其中，Xaa可以是除脯氨酸(Pro)外的任何氨基酸，多為賴氨酸、纈氨酸、

苯丙氨酸。該類彈性蛋白多肽(ELPs)在以下發(fā)明人所公開發(fā)表的文獻(xiàn)中均有提到：[1]黃凱

宗，李晶晶，李巍，葛慧華，王文研，張光亞.類彈性蛋白多肽的從頭設(shè)計(jì)、非色譜純化及鹽效

應(yīng)[J].生物工程學(xué)報(bào)，2011，27(4)：653?658.[2]付曉平，王文研，張光亞.以類彈性蛋白多

肽為標(biāo)簽的表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建及其用于木聚糖酶的非色譜純化[J].微生物學(xué)報(bào)，2012，52(1)：

90?95.[3]李存存，張光亞.酶定向固定化方法及應(yīng)用的研究進(jìn)展[J].化工進(jìn)展，2013，32

(10)：2467?2474.[4]發(fā)明人在先申請(qǐng)的申請(qǐng)?zhí)枮?01010562100.5的發(fā)明專利公開的一種

能對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行非色譜分離的融合標(biāo)簽蛋白及其編碼基因和制備方法。

發(fā)明內(nèi)容[0007] 在下文中給出了關(guān)于本發(fā)明實(shí)施例的簡要概述，以便提供關(guān)于本發(fā)明的某些方面的基本理解。應(yīng)當(dāng)理解，以下概述并不是關(guān)于本發(fā)明的窮舉性概述。它并不是意圖確定本發(fā)

明的關(guān)鍵或重要部分，也不是意圖限定本發(fā)明的范圍。其目的僅僅是以簡化的形式給出某

些概念，以此作為稍后論述的更詳細(xì)描述的前序。

[0008] 根據(jù)本申請(qǐng)的一個(gè)方面，提供一種多肽介導(dǎo)的仿生二氧化硅納米粒子的制備方法，其包括：

[0009] 步驟1：采用ITC純化法制備高純度的類彈性蛋白多肽ELPs；[0010] 此步驟中，現(xiàn)有技術(shù)的ITC純化法一般是如下過程：首先對(duì)ELPs溶液加熱使之發(fā)生相變，在高于Tt條件下離心去收集沉淀；接著，用預(yù)冷的緩沖液溶解沉淀，在低溫條件下離

心，收集上清，此即為純化的ELPs；重復(fù)上述ITC純化過程，直至純化后的ELPs達(dá)到純度；其

中，ITC純化過程所需的次數(shù)，因目的蛋白及ELPs的不同會(huì)有差異，通常經(jīng)過2～5次ITC純化

過程即可獲得較高純度的蛋白；

[0011] 本發(fā)明采用改進(jìn)的ITC純化法來實(shí)現(xiàn)快速制備高純度的類彈性蛋白多肽ELPs。其原理是，由于能量傳遞和局部產(chǎn)熱等原因，很難用于大體積細(xì)胞懸液的破碎，這樣部分未破

碎細(xì)胞與包涵體混在一起，給后期純化帶來困難，為降低離心后收集的沉淀中的包涵體，本

申請(qǐng)對(duì)離心后的沉淀進(jìn)行復(fù)性處理，降低無活性的固體顆粒的比例，從而提高純化速度。其

中，對(duì)離心后的沉淀進(jìn)行復(fù)性處理具體包括：首先對(duì)沉淀在低溫下(約?18℃至0℃)進(jìn)行快

速(10秒內(nèi))脫水處理，并對(duì)脫水處理后的沉淀進(jìn)行適度震碎(可用超聲震碎)，獲得固態(tài)顆

粒物，然后對(duì)該固態(tài)顆粒物進(jìn)行過篩、風(fēng)選或者高壓靜電吸附(利用變性鹽結(jié)晶比重)，將大

部分包涵體去除，獲得復(fù)性后的沉淀。上述脫水處理過程需要快速而短暫且在低溫下進(jìn)行，

可避免影響復(fù)性后的蛋白的穩(wěn)定性以及活性。上述過程作為第一次的復(fù)性處理，優(yōu)選的復(fù)

性過程還包括第二次的復(fù)性處理：將第一次的復(fù)性處理后的固態(tài)顆粒物在低溫(約?18℃

至?10℃)下折疊復(fù)性以減少蛋白質(zhì)聚集的形成，當(dāng)形成聚集體的中間體已經(jīng)減少時(shí)，迅速

將溫度提高約10度左右(保證提高溫度后的溫度仍小于0度)，以促進(jìn)蛋白質(zhì)折疊復(fù)性，從而

可獲得高復(fù)性效率的固態(tài)顆粒。特殊情況下，上述第二次復(fù)性處理可以執(zhí)行2次(一般一次

即可)以進(jìn)一步提高復(fù)性效率。同時(shí)，第二次的復(fù)性處理還可以是以復(fù)性溶液來復(fù)性的方

案，例如將固態(tài)顆粒物緩慢加入混合了銅離子的復(fù)性溶液(一般的緩沖液平衡液，例如十二

烷基硫酸鈉溶液、磷酸緩沖鹽溶液PBS等)，在特定溫度(例如25?35℃)下反應(yīng)預(yù)設(shè)時(shí)間(例

如1小時(shí))，再加入抑制劑、復(fù)性劑等終止反應(yīng)，最后對(duì)該溶液進(jìn)行離心獲得沉淀。一般說來，

蛋白質(zhì)的復(fù)性效率在20％左右，本申請(qǐng)的復(fù)性效率可達(dá)60％。

[0012] 本申請(qǐng)?jiān)诂F(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)上增加了對(duì)沉淀的復(fù)性處理過程，大大提高了純化速度，實(shí)驗(yàn)證明，現(xiàn)有技術(shù)的方案需要經(jīng)過2～5次ITC純化過程來獲得較高純度的蛋白，使用

本申請(qǐng)的方案，只需要1次即可達(dá)到所需的純度。不僅如此，上述復(fù)性處理后產(chǎn)物為固態(tài)顆

粒物(比原來的沉淀物的粒徑更小)，具有很好的分散性，更有利于其在步驟2混合溶液的分

散和溶液充分接觸反應(yīng)，加快反應(yīng)速度。此外，增加復(fù)性過程的方案與現(xiàn)有技術(shù)的方案相

比，由于其活性蛋白變多，在后續(xù)的二氧化硅的制備過程中獲得了非常好的促進(jìn)作用。

[0013] 步驟2：類彈性蛋白多肽ELPs介導(dǎo)二氧化硅粒子沉淀，獲得仿生二氧化硅納米粒子；具體包括如下過程：將步驟1得到的類彈性蛋白多肽ELPs溶解于PBS緩沖液得到ELPs溶

液，類彈性蛋白多肽ELPs的濃度范圍為10μmol/L?100μmol/L，pH＝(6.9?7.1)；由SiO2前體

溶解于溶液中配制硅源溶液，SiO2前體可選四甲基硅烷或者四乙基硅烷；將體積為a的ELPs

溶液與體積為b的硅源溶液混合，a∶b＝(9?11)∶1；混合均勻后在室溫下靜置預(yù)設(shè)時(shí)間

(5min)，高速離心(10,000rpm，離心3min)，收集二氧化硅沉淀，即可得到二氧化硅/ELPs復(fù)

合材料(仿生二氧化硅納米粒子)。

[0014] 現(xiàn)有的多肽介導(dǎo)二氧化硅粒子沉淀獲得的仿生二氧化硅納米粒子很難形成規(guī)則的球形，這是因?yàn)镾iO2是一種空間立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，每一個(gè)硅原子與周圍的四個(gè)氧原子形成

一個(gè)Si、O正四面體，即硅原子位于正四面體的中心，四個(gè)氧原子位于正四面體的四個(gè)頂點(diǎn)

上，每一個(gè)氧原子參與形成2個(gè)Si、O正四面體，即每一個(gè)硅原子與周圍的四個(gè)氧原子可以形

成四個(gè)Si?O單鍵，而在微觀結(jié)構(gòu)上，其在硅源溶液中很容易發(fā)生團(tuán)聚現(xiàn)象，容易產(chǎn)生聚集，

那么在硅源溶液與ELPs溶液混合時(shí)，無法充分混合，因此最終獲得的二氧化硅納米粒子常

常受到干擾而無法獲得規(guī)則的球形。因此，本申請(qǐng)為了改進(jìn)上述問題，針對(duì)此步驟同樣進(jìn)行

了改進(jìn)，對(duì)硅源溶液進(jìn)行改進(jìn)，改進(jìn)過程如下：配制硅源溶液：將質(zhì)量為c(單位為克)的SiO2

前體(例如四甲基硅烷TMOS)溶于濃度為d(單位為mmol/L)的鹽酸中，定容v(單位為mL)即可

獲得硅源溶液；配制離散石墨溶液：將質(zhì)量為e(單位為克)的石墨溶于濃度為d(單位為

mmol/L)的鹽酸中，其中，c＞5e，定容v(單位為mL)，然后進(jìn)行超聲共混獲得離散石墨溶液；

然后將硅源溶液和離散石墨溶液混合并高速攪拌預(yù)設(shè)時(shí)間，即可得到混合硅源溶液；其中

混合硅源溶液優(yōu)選通過如下過程獲得：將石墨加入鹽酸，進(jìn)行超聲攪拌預(yù)設(shè)時(shí)間(至少3小

時(shí))，得到懸濁液，然后將懸濁液和硅源溶液快速(幾秒內(nèi))混合，在35?60℃進(jìn)行攪拌預(yù)設(shè)時(shí)

間(一般要超過30min)，即可得到混合硅源溶液。

[0015] 其中，石墨的空間結(jié)構(gòu)是一種層狀結(jié)構(gòu)，在每一層中，每一個(gè)碳原子參與形成3個(gè)平面正六邊形，通過將石墨的層狀結(jié)構(gòu)將SiO2的立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)進(jìn)行分散化，使其大大減少

團(tuán)聚現(xiàn)象，因此當(dāng)硅源溶液與ELPs溶液混合時(shí)，可實(shí)現(xiàn)充分混合，進(jìn)而可獲得規(guī)則的球形結(jié)

構(gòu)的仿生二氧化硅納米粒子。同時(shí)，通過掃描電鏡與透射電鏡觀察二氧化硅粒子的大小和

形貌，得到二氧化硅粒子呈規(guī)則的球形，粒子直徑大小集中在70nm至400nm之間。

[0016] 此外，混合硅源溶液由于加入了石墨，ELPs溶液與混合硅源溶液混合后獲得的二氧化硅沉淀里面有石墨，為此，根據(jù)石墨導(dǎo)電而二氧化硅不導(dǎo)電，可通過配制電解液并通電

(在電解液中插入兩個(gè)電極，用電源在兩電極間加上一定的電壓時(shí)，石墨被吸附至電極，然

后電解液的最終沉淀物即是仿生二氧化硅納米粒子)，上述電解液的配制以及通電過程本

領(lǐng)域的技術(shù)人員可參閱相關(guān)材料獲得，例如格拉斯通著，賈立德等譯：《電化學(xué)概論》，科學(xué)

出版社，北京，1958。(S.Glasstone，AnlntroductiontoElectrochemistry，an

Nostrand，NewYork，1947.)，本文不再贅述。

[0017] 此外，在實(shí)驗(yàn)條件下，并不是離散石墨溶液中石墨的質(zhì)量越高最后獲得的二氧化?3

硅粒子的粒子越多、形態(tài)越好，石墨的質(zhì)量百分比濃度ω，ω＝質(zhì)量e*10 /12*v(石墨的摩

爾質(zhì)量為12g/mol，離散石墨溶液體積質(zhì)量濃度＝(石墨的摩爾質(zhì)量×mmol/1000)/l＝g/

l)，通過對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，得到石墨的質(zhì)量百分比濃度ω優(yōu)選為3wt％?3.7wt％，也可

表達(dá)為5.5e＜c＜7e。

[0018] 優(yōu)選的，上述生成的類彈性蛋白多肽ELPs的氨基酸序列為ELP[K8F?s]，ELP[K8F?s]即指連續(xù)的10個(gè)PGXG五肽單元中，每個(gè)五肽的第4位Xaa有1個(gè)賴氨酸(K)、8個(gè)纈氨酸

()、1個(gè)苯丙氨酸(F)，s即指有s個(gè)以PGXG為單元的重復(fù)序列。類彈性蛋白多肽ELPs是一種

能應(yīng)答溫度變化的人造基因工程蛋白，它包含數(shù)個(gè)重復(fù)序列(PGXG)n，其中X代表除脯氨酸

以外的任一氨基酸，不同X的設(shè)計(jì)組合能產(chǎn)生性能各異的ELPs。根據(jù)本申請(qǐng)的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證以及

推論，其他帶有類似氨基酸的ELPs序列也可以實(shí)現(xiàn)本申請(qǐng)的介導(dǎo)作用，且重復(fù)數(shù)s的變化范

圍為10???300。例如s＝40，則ELPs記為ELP40，其基因序列則為ELP[K8F?40]，ELP[K8F?40]

即指連續(xù)的10個(gè)PGXG五肽單元中，每個(gè)五肽的第4位Xaa有1個(gè)賴氨酸(K)、8個(gè)纈氨酸()、1

個(gè)苯丙氨酸(F)，40即指有40個(gè)以PGXG為單元的重復(fù)序列。

[0019] 根據(jù)本申請(qǐng)的另一方面，提供一種由上述方法得到的仿生二氧化硅納米粒子的應(yīng)用，其中，所述仿生二氧化硅納米粒子用于酶的自固定化。

[0020] 根據(jù)本申請(qǐng)的再一方面，提供一種由上述方法得到的仿生二氧化硅納米粒子的應(yīng)用，所述仿生二氧化硅納米粒子作為的緩釋藥物的載體。

[0021] 本申請(qǐng)通過上述方案，與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)勢：[0022] 1、類彈性蛋白多肽ELPs采用ELP40(發(fā)明人在先申請(qǐng)的申請(qǐng)?zhí)枮?01510042517.1的發(fā)明專利公開的一種蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)的制備方法已公開其基因序列)實(shí)現(xiàn)，ELP40在反

應(yīng)前后都能保留其相變的性質(zhì)，因此最后獲得的ELP?二氧化硅雜化材料比傳統(tǒng)的化學(xué)或者

生物法合成的二氧化硅有更為廣闊的應(yīng)用前景。此外，由實(shí)驗(yàn)過程可知，ELP40既是催化二

氧化硅的形成的催化劑，其本身又被包埋固定在自己催化形成的二氧化硅載體上，該反應(yīng)

過程既是二氧化硅形成的過程，又是ELP40自催化固定化的過程，該反應(yīng)條件溫和、設(shè)備簡

單、操作方便、容易達(dá)到工業(yè)化規(guī)模，具有重要的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值和巨大的應(yīng)用潛力；工業(yè)上，

可以應(yīng)用于固定化酶領(lǐng)域；生物醫(yī)學(xué)方面，可以作為良好的藥物載體，尤其是緩釋藥物，具

有非常好的應(yīng)用前景。

[0023] 2、在ITC純化過程中，增加了對(duì)沉淀的復(fù)性處理，大大提高了純化速度，現(xiàn)有技術(shù)的方案需要經(jīng)過2～5次ITC純化過程來獲得較高純度的蛋白，實(shí)驗(yàn)證明，使用本申請(qǐng)的方

案，只需要1次即可達(dá)到所需的純度；不僅如此，上述復(fù)性處理后產(chǎn)物為固態(tài)顆粒物(比原來

的沉淀物的粒徑更小)，具有很好的分散性，更有利于其在步驟2混合溶液的分散和溶液充

分接觸反應(yīng)，加快反應(yīng)速度。此外，增加復(fù)性過程的方案與現(xiàn)有技術(shù)的方案相比，由于其活

性蛋白變多，在后續(xù)的二氧化硅的制備過程中獲得了非常好的促進(jìn)作用；

[0024] 3、對(duì)于類彈性蛋白多肽ELPs介導(dǎo)二氧化硅粒子沉淀中，對(duì)硅源溶液進(jìn)行改進(jìn)使其與離散石墨溶液超聲混合，在微觀結(jié)構(gòu)上由石墨的層狀結(jié)構(gòu)阻止二氧化硅的立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)

的相互聚集，使二氧化硅粒子的間距變大，且其堆砌的更加疏松，這種疏松的結(jié)構(gòu)可以使得

SiO2前體與ELPs溶液的其他分子充分接觸，以形成疏松的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，因此當(dāng)改進(jìn)后的硅源

溶液與ELPs溶液混合時(shí)，可實(shí)現(xiàn)充分混合，進(jìn)而可獲得規(guī)則的球形結(jié)構(gòu)的仿生二氧化硅納

米粒子(且粒徑分布更集中，粒子直徑大小在70nm至400nm之間，現(xiàn)有技術(shù)的粒徑一般在幾

十納米到幾十微米之間)；

[0025] 4、此外，在對(duì)硅源溶液進(jìn)行改進(jìn)過程中，還通過對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，得到石墨的質(zhì)量百分比濃度ω優(yōu)選為3wt％?3.7wt％，也可表達(dá)為5.5e＜c＜7e，此種情況下獲得更佳

的仿生二氧化硅納米粒子，形狀更為規(guī)則，粒徑更加集中。

附圖說明[0026] 本發(fā)明可以通過參考下文中結(jié)合附圖所給出的描述而得到更好的理解。所述附圖連同下面的詳細(xì)說明一起包含在本說明書中并且形成本說明書的一部分，而且用來進(jìn)一步

舉例說明本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例和解釋本發(fā)明的原理和優(yōu)點(diǎn)。在附圖中：

[0027] 圖1為ELP40介導(dǎo)形成的二氧化硅粒子SEM分析；[0028] 圖2a為ELP40介導(dǎo)形成的二氧化硅粒子TEM分析示意圖一；[0029] 圖2b為ELP40介導(dǎo)形成的二氧化硅粒子TEM分析示意圖二；[0030] 圖3為ELP40濃度對(duì)二氧化硅沉淀量的影響；[0031] 圖4為溶液pH值對(duì)二氧化硅沉淀量的影響；[0032] 圖5為反應(yīng)溫度對(duì)二氧化硅沉淀量的影響；[0033] 圖6為反應(yīng)時(shí)間對(duì)二氧化硅沉淀量的影響；[0034] 圖7為二氧化硅粒子中釋放的ELP40SDS?PAGE分析；[0035] 圖8為蛋白ELP40表達(dá)及純化的SDS?PAGE分析。具體實(shí)施方式[0036] 下面將參照附圖來說明本發(fā)明的實(shí)施例。應(yīng)當(dāng)注意，為了清楚的目的，附圖和說明中省略了與本發(fā)明無關(guān)的、本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的部件和處理的表示和描述。

[0037] 本發(fā)明提供一種多肽介導(dǎo)的仿生二氧化硅納米粒子的快速制備方法，其包括：[0038] 步驟1：采用ITC純化法制備高純度的類彈性蛋白多肽ELP40；作為一個(gè)具體的實(shí)例，該過程具體包括：

[0039] 準(zhǔn)備工作：清理超凈工作臺(tái)，紫外滅菌20min；氨芐青霉素鈉按1∶1000(氨芐青霉素鈉∶培養(yǎng)基，v/v)比例，如10mL的培養(yǎng)基加10μL；甘油菌按1∶100(菌種∶培養(yǎng)基，v/v)比例的

接種量加入到LB液體培養(yǎng)基中，如10mL的培養(yǎng)基加100μL的菌種；培養(yǎng)基置于37℃、200rpm

恒溫?fù)u床培養(yǎng)10?12h。

[0040] 擴(kuò)大培養(yǎng)及誘導(dǎo)表達(dá)：接種前，清理超凈工作臺(tái)，并紫外滅菌20min；接種：氨芐青霉素鈉按1∶1000的比例、活化的菌種按1∶100的比例加入到TB培養(yǎng)基中，如200mL的培養(yǎng)基

加200μL的氨芐青霉素鈉和2mL的菌種；擴(kuò)大培養(yǎng)：將接種好培養(yǎng)基置于37℃、200rpm恒溫?fù)u

床培養(yǎng)2?4h，OD600值介于0.6?0.8之間，此時(shí)，菌體處于對(duì)數(shù)生長期；

[0041] 誘導(dǎo)表達(dá)：將IPTG按1∶200(IPTG∶培養(yǎng)基，v/v)加入到上述培養(yǎng)基中(如200mL的培養(yǎng)基添加1mL)，將培養(yǎng)基置于37℃、200rpm恒溫?fù)u床繼續(xù)培養(yǎng)24h誘導(dǎo)目的基因過量表達(dá)。

[0042] 細(xì)胞收集及破碎：將上述培養(yǎng)好的菌液分裝于500mL離心管中(不要超過離心管體積的2/3)，4000rpm，常溫離心20min；棄掉上清液，按1∶25(PBS緩沖溶液∶菌液，v/v)的比例

加入PBS緩沖溶液，洗滌菌體兩次，4℃，10000rpm離心10min，收集細(xì)胞；棄掉上清液，按1∶25

(PBS緩沖溶液∶菌液，v/v)的比例加入PBS緩沖溶液，重懸菌液，至于冰浴中進(jìn)行超聲破碎。

超聲粉碎條件：功率為300W，超聲2s，間隔4s，循環(huán)次數(shù)為200次，超聲時(shí)間12min。細(xì)胞破碎

液于4℃，10000rpm，離心10min，上清為細(xì)胞粗提物。

[0043] 蛋白的ITC純化：向細(xì)胞粗提物中加入固體NaCl(2mol/L)，觸發(fā)ELPs發(fā)生相變，37℃恒溫水浴20min后，30℃，10000rpm，離心10min；棄上清液，收集沉淀，對(duì)離心后的沉淀進(jìn)

行復(fù)性處理；在復(fù)性處理后的沉淀物中加入4℃預(yù)冷的PBS緩沖溶液以溶解沉淀的蛋白，先

用移液槍將沉淀吹打起來，充分混勻，4℃冰浴30min(盡可能使沉淀的目標(biāo)蛋白充分溶解)，

10000rpm，離心10min，收集上清液；最終上清為純ELP40。蛋白ELP40表達(dá)及純化的SDS?PAGE

分析參見圖8。

[0044] 本申請(qǐng)中上述類彈性蛋白多肽ELPs采用ELP40實(shí)現(xiàn)，ELP40的基因序列為ELP[K8F?40]，ELP[K8F?40]即指連續(xù)的10個(gè)PGXG五肽單元中，每個(gè)五肽的第4位Xaa有1個(gè)賴

氨酸(K)、8個(gè)纈氨酸()、1個(gè)苯丙氨酸(F)，40即指有40個(gè)以PGXG為單元的重復(fù)序列。該序

列已進(jìn)行菌種專利保藏(中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)CGMCC

NO.4185，保藏日期：2010年9月17日)，并在申請(qǐng)?zhí)枮?01010562100.5的發(fā)明專利中公開。

[0045] 此步驟中，現(xiàn)有技術(shù)的ITC純化法一般是如下過程：首先對(duì)ELPs溶液加熱使之發(fā)生相變，在高于Tt條件下離心去收集沉淀；接著，用預(yù)冷的緩沖液溶解沉淀，在低溫條件下離

心，收集上清，此即為純化的ELPs；重復(fù)上述ITC純化過程，直至純化后的ELPs達(dá)到純度；其

中，ITC純化過程所需的次數(shù)，因目的蛋白及ELPs的不同會(huì)有差異，通常經(jīng)過2～5次ITC純化

過程即可獲得較高純度的蛋白。本申請(qǐng)?jiān)诂F(xiàn)有技術(shù)上增加了一個(gè)對(duì)沉淀進(jìn)行復(fù)性處理的步

驟，將現(xiàn)有技術(shù)的多次純化過程縮短為1次即可。

[0046] 其中，對(duì)離心后的沉淀進(jìn)行復(fù)性處理具體包括：首先使離心后的沉淀在?12℃溫度下在10秒內(nèi)進(jìn)行快速脫水處理，并對(duì)脫水處理后的沉淀進(jìn)行適度震碎(可用超聲震碎)，獲

得固態(tài)顆粒物，然后對(duì)該固態(tài)顆粒物進(jìn)行過篩、風(fēng)選或者高壓靜電吸附(利用變性鹽結(jié)晶比

重)，將大部分包涵體去除，獲得復(fù)性后的沉淀。上述脫水處理過程需要快速而短暫且在低

溫下進(jìn)行，可避免影響復(fù)性后的蛋白的穩(wěn)定性以及活性。上述過程作為第一次的復(fù)性處理，

優(yōu)選的復(fù)性過程還包括第二次的復(fù)性處理：將第一次的復(fù)性處理后的固態(tài)顆粒物在?12℃

低溫下折疊復(fù)性以減少蛋白質(zhì)聚集的形成，當(dāng)形成聚集體的中間體已經(jīng)減少時(shí)，迅速將溫

度提高約10度左右(約2度)，以促進(jìn)蛋白質(zhì)折疊復(fù)性，最后慢慢恢復(fù)室溫，從而可獲得高復(fù)

性效率的固態(tài)顆粒。特殊情況下，上述第二次復(fù)性處理可以執(zhí)行2次(一般一次即可)以進(jìn)一

步提高復(fù)性效率。同時(shí)，第二次的復(fù)性處理還可以是以復(fù)性溶液來復(fù)性的方案，例如將固態(tài)

顆粒物緩慢加入混合了銅離子的復(fù)性溶液(一般的緩沖液平衡液，例如十二烷基硫酸鈉溶

液、磷酸緩沖鹽溶液PBS等)，在特定溫度(例如25?35℃)下反應(yīng)預(yù)設(shè)時(shí)間(例如1小時(shí))，再加

入抑制劑、復(fù)性劑等終止反應(yīng)，最后對(duì)該溶液進(jìn)行離心獲得沉淀。一般說來，蛋白質(zhì)的復(fù)性

效率在20％左右，本申請(qǐng)的復(fù)性效率可達(dá)60％。

[0047] 本申請(qǐng)?jiān)诂F(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)上增加了對(duì)沉淀的復(fù)性處理過程，大大提高了純化速度，實(shí)驗(yàn)證明，現(xiàn)有技術(shù)的方案需要經(jīng)過2～5次ITC純化過程來獲得較高純度的蛋白，使用

本申請(qǐng)的方案，只需要1次即可達(dá)到所需的純度。雖然本申請(qǐng)加入了復(fù)性過程，然而整個(gè)復(fù)

性過程簡單易于實(shí)現(xiàn)，因此，整體比較起來，本申請(qǐng)的方案能更快的實(shí)現(xiàn)高度純化。非常不

僅如此，上述復(fù)性處理后產(chǎn)物為固態(tài)顆粒物(比原來的沉淀物的粒徑更小)，具有很好的分

散性，更有利于其在步驟2混合溶液的分散和溶液充分接觸反應(yīng)，加快反應(yīng)速度。此外，增加

復(fù)性過程的方案與現(xiàn)有技術(shù)的方案相比，由于其活性蛋白變多，在后續(xù)的二氧化硅的制備

過程中獲得了非常好的促進(jìn)作用。

[0048] 步驟2：類彈性蛋白多肽ELP40介導(dǎo)二氧化硅粒子沉淀，獲得仿生二氧化硅納米粒子；具體包括如下過程：

[0049] 將步驟1得到的類彈性蛋白多肽ELP40溶解于PBS緩沖液得到ELP40溶液，濃度為100μmol/L，pH＝7；

[0050] 取10μL的1mmol/L溶解于鹽酸的TMOS制成硅源溶液；同時(shí)，本申請(qǐng)還對(duì)硅源溶液進(jìn)行改進(jìn)，具體制備方法如下：配制離散石墨溶液：將質(zhì)量為0.2g的石墨溶于濃度為1mmol/L

的鹽酸中，定容至10mL，然后進(jìn)行超聲共混獲得離散石墨溶液；然后將上述制成的硅源溶液

和離散石墨溶液混合并高速攪拌30分鐘，即可得到混合硅源溶液；其中混合硅源溶液可通

過如下過程獲得：將石墨加入鹽酸，進(jìn)行超聲攪拌預(yù)設(shè)時(shí)間(至少3小時(shí))，得到懸濁液，然后

將懸濁液和硅源溶液快速(幾秒內(nèi))混合，在35?60℃進(jìn)行攪拌預(yù)設(shè)時(shí)間(一般要超過

30min)，即可得到混合硅源溶液；

[0051] 將ELP40溶液和混合硅源溶液(改進(jìn)后的硅源溶液)混合，混合均勻后在室溫下靜置預(yù)設(shè)時(shí)間(5min)，高速離心(10,000rpm，離心3min)，收集二氧化硅沉淀；

[0052] 即可得到二氧化硅/ELP40復(fù)合材料，即仿生二氧化硅納米粒子。[0053] 此外，混合硅源溶液由于加入了石墨，ELPs溶液與混合硅源溶液混合后獲得的二氧化硅沉淀里面有石墨，為此，根據(jù)石墨導(dǎo)電而二氧化硅不導(dǎo)電，可通過配制電解液并通電

(在電解液中插入兩個(gè)電極，用電源在兩電極間加上一定的電壓時(shí)，石墨被吸附至電極，然

后電解液的最終沉淀物即是仿生二氧化硅納米粒子)，上述電解液的配制以及通電過程本

領(lǐng)域的技術(shù)人員可參閱相關(guān)材料獲得，例如格拉斯通著，賈立德等譯：《電化學(xué)概論》，科學(xué)

出版社，北京，1958。(S.Glasstone，AnlntroductiontoElectrochemistry，an

Nostrand，NewYork，1947.)，本文不再贅述。

[0054] 其中，石墨的空間結(jié)構(gòu)是一種層狀結(jié)構(gòu)，在每一層中，每一個(gè)碳原子參與形成3個(gè)平面正六邊形，通過將石墨的層狀結(jié)構(gòu)將SiO2的立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)進(jìn)行分散化，使其大大減少

團(tuán)聚現(xiàn)象，因此當(dāng)硅源溶液與ELPs溶液混合時(shí)，可實(shí)現(xiàn)充分混合，進(jìn)而可獲得規(guī)則的球形結(jié)

構(gòu)的仿生二氧化硅納米粒子。得到的仿生二氧化硅納米粒子的尺寸為700nm至1000nm，仿生

二氧化硅納米粒子中二氧化硅的質(zhì)量百分比為10％?99％。同時(shí)，通過掃描電鏡與透射電鏡

觀察二氧化硅粒子的大小和形貌，得到二氧化硅粒子呈規(guī)則的球形，粒子直徑大小集中在

70nm至400nm之間。

[0055] 為了用于掃描電子顯微鏡和投射電鏡分析，則需要將實(shí)驗(yàn)最終得到的二氧化硅/ELP40復(fù)合材料置于低溫冷凍干燥12h，然后70℃真空干燥箱中干燥12h。ELP40介導(dǎo)形成的

二氧化硅粒子SEM分析參見圖1所示，ELP40介導(dǎo)形成的二氧化硅粒子TEM分析參見圖2a和圖

2b所示，圖2a中，二氧化硅粒子在型號(hào)為S4800的電子顯微鏡，以工作電壓為5萬伏，工作距

離為8.2mm，放大4萬倍得到的TEM分析圖，圖2b是二氧化硅粒子在型號(hào)為S4800的電子顯微

鏡，以工作電壓為5萬伏，工作距離為8.5mm，放大1.3萬倍得到的TEM分析圖。

[0056] 此外，ELP40濃度對(duì)二氧化硅沉淀量的影響參見圖3，當(dāng)ELP40濃度為10μmol/L?100μmol/L之間時(shí)，二氧化硅沉淀量隨著ELP40濃度的增加而增加。在這一濃度范圍內(nèi)，反應(yīng)尚

未達(dá)到飽和狀態(tài)。

[0057] 圖4為溶液pH值對(duì)二氧化硅沉淀量的影響示意圖，由圖可知在pH為7.0的反應(yīng)條件下，生成的二氧化硅沉淀量最多。因此，當(dāng)pH為7.0時(shí)，是ELP40介導(dǎo)二氧化硅礦化的最適反

應(yīng)pH值。

[0058] 圖5為反應(yīng)溫度對(duì)二氧化硅沉淀量的影響示意圖，當(dāng)反應(yīng)溫度為45℃時(shí)，生成二氧化硅沉淀量最多。因此，當(dāng)溫度為45℃時(shí)，是ELP40介導(dǎo)二氧化硅礦化的最適反應(yīng)溫度。

[0059] 圖6為反應(yīng)時(shí)間對(duì)二氧化硅沉淀量的影響，由圖可知，隨著反應(yīng)時(shí)間逐漸增加，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間達(dá)到10min后，生成的二氧化硅沉淀量趨于穩(wěn)定。因此，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間設(shè)為10min時(shí)，

能夠得到較好的反應(yīng)結(jié)果，同時(shí)也能節(jié)省反應(yīng)時(shí)間。

[0060] 圖7為二氧化硅粒子中釋放的ELP40SDS?PAGE分析，圖中泳道1是介導(dǎo)二氧化硅沉積之前的ELP40，泳道2是利用氫氧化鈉溶解二氧化硅而釋放出來的ELP40，可以看出EL40P

的分子量在介導(dǎo)二氧化硅形成的前后沒有發(fā)生變化。此外，ELP40在反應(yīng)前后都能保留其相

變的性質(zhì)，因此，ELP40?二氧化硅雜化材料比傳統(tǒng)的化學(xué)或者生物法合成的二氧化硅或許

有更為廣闊的應(yīng)用前景。從圖中，還可以看出EL40P在反應(yīng)的過程同時(shí)被包埋在二氧化硅粒

子里面。因此，在這一反應(yīng)過程中，二氧化硅的形成和ELP的固定化是同步進(jìn)行并完成的。綜

上所述，ELP40既是催化二氧化硅的形成的催化劑，其本身又被包埋固定在自己催化形成的

二氧化硅載體上。該反應(yīng)過程既是二氧化硅形成的過程，又是ELP40自催化固定化的過程。

該反應(yīng)條件溫和、設(shè)備簡單、操作方便、容易達(dá)到工業(yè)化規(guī)模，具有重要的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值和

巨大的應(yīng)用潛力。工業(yè)上，可以應(yīng)用于固定化酶領(lǐng)域；生物醫(yī)學(xué)方面，可以作為良好的藥物

載體，尤其是緩釋藥物。

[0061] 此外，在實(shí)驗(yàn)條件下，并不是離散石墨溶液中石墨的質(zhì)量越高最后獲得的二氧化?3

硅粒子的粒子越多、形態(tài)越好，石墨的質(zhì)量百分比濃度ω，ω＝質(zhì)量e*10 /12*v，(石墨的摩

爾質(zhì)量為12g/mol，離散石墨溶液體積質(zhì)量濃度＝(石墨的摩爾質(zhì)量×mmol/1000)/l＝g/

l)，v為離散石墨溶液的體積，單位為mL，通過對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，得到石墨的質(zhì)量百分比

濃度ω優(yōu)選為3wt％?3.7wt％，5.5e＜c＜7e，c為SiO2前體(TMOS)的質(zhì)量。

[0062] 本申請(qǐng)通過上述步驟在不同條件下實(shí)驗(yàn)ELP40仿生礦化形成二氧化硅的產(chǎn)量與粒子大小形貌的關(guān)系，結(jié)果表明：ELP40介導(dǎo)二氧化硅礦化的最適反應(yīng)pH是7.0，最適反應(yīng)溫度

為45℃，二氧化硅沉淀量隨著ELP40濃度的增加而增加，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間達(dá)到10min后生成的二

氧化硅沉淀量趨于穩(wěn)定。ELP40介導(dǎo)形成的二氧化硅粒子為規(guī)則的球形，直徑為70?400nm。

[0063] 本實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)材料的獲取方案羅列如下：[0064] A、菌種和質(zhì)粒均為實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存。[0065] (1)菌種：大腸桿菌E.coliBL21(DE3)為基因表達(dá)的宿主菌。[0066] (2)質(zhì)粒：pET?22b(+)?ELP40。[0067] B、主要實(shí)驗(yàn)試劑均為分析純或市面所能買到的最高純度。[0068] C、主要培養(yǎng)基配方[0069] C.1LB種子培養(yǎng)基[0070] LB培養(yǎng)基：Tryptone1.0g，YeastExtract0.5g，NaCl1.0g，蒸餾水100mL。[0071] C.2TB擴(kuò)大培養(yǎng)基[0072] 培養(yǎng)基：Tryptone12.0g，YeastExtract24.0g，Glycerol4.5mL，NH4Cl3.0g，加蒸餾水900mL溶解，121℃高壓滅菌20min；

[0073] 磷酸鹽溶液：K2HPO4·12H2O16.43g，KH2PO42.31g，蒸餾水100mL；121℃高壓滅菌20min；

[0074] 將上述兩種滅菌的溶液冷卻至室溫，混合即為TB培養(yǎng)基。[0075] D、實(shí)驗(yàn)溶液配制[0076] (1)100mg/mL氨芐青霉素鈉：稱取氨芐青霉素鈉1.00g，溶于ddH2O，定容至10mL，用0.22μm的濾膜過濾除菌，分裝后，于?20℃保存。

[0077] (2)100mmol/L的IPTG：稱取IPTG2.38g，溶于ddH2O，定容至100mL，用0.22μm的濾膜過濾除菌，分裝后，于?20℃避光保存。

[0078] (3)緩沖液：[0079] IPBS緩沖液：[0080] A液(0.2mol/L磷酸氫二鈉溶液)：稱取Na2HPO4·12H2O71.64g，溶于蒸餾水中，定容至1000mL。

[0081] B液(0.2mol/L磷酸二氫鈉溶液)：稱取Na2HPO424.0g，溶于蒸餾水中，定容至1000mL。

[0082][0083] 表10.2mol/LPBS緩沖液[0084] 按表1比例混合A、B液，加等體積的蒸餾水即為0.1mol/L不同pH值的PBS緩沖溶液。[0085] II磷酸氫二鈉?檸檬酸緩沖液：[0086] A液(0.2mol/LNa2HPO4)：稱取Na2HPO4·12H2O71.64g，溶于去離子水中，定容至1000mL。

[0087] B液(0.1mol/L檸檬酸)：稱取C6H8O7·H2O21.01g，溶于去離子水中，定容至1000mL。

[0088][0089][0090] 表20.1mol/L檸檬酸和0.2mol/L磷酸氫二鈉緩沖液[0091] 按表2比例混合A、B液，即為不同pH的磷酸氫二鈉?檸檬酸緩沖液。[0092] 配100mL的100μg/mL的二氧化硅的標(biāo)準(zhǔn)溶液：用移液槍取1000μg/mL的二氧化硅溶液10mL，用0.05M氫氧化鈉溶液定容于100mL容量瓶。

[0093] 按表3，用移液槍將100μg/mL，然后0.05M氫氧化鈉溶液定容10mL，配成不同濃度的二氧化硅溶液。

[0094][0095] 表3不同濃度的二氧化硅溶液[0096] (6)1mmol/L鹽酸的配制：先配制濃度1mol/L，取8.6mL36％的鹽酸加水、攪拌、定容至100mL。取1mL的1mmol/L鹽酸，稀釋，定容至100mL。

[0097] (7)1mol/L的硅酸溶液的配制：稱取1.522g的四甲基硅烷(TMOS)，用1mmol/L的鹽酸溶解，定容至10mL，得到新鮮配制的硅酸溶液，室溫靜置15min，即可直接作為硅源。硅酸

宜現(xiàn)配現(xiàn)用。

[0098] 此外，本申請(qǐng)關(guān)于實(shí)驗(yàn)材料的未盡事宜可參閱發(fā)明人同期發(fā)表(包括指導(dǎo)學(xué)生發(fā)表)的其他文章或論文來獲得。

[0099] 本申請(qǐng)還提供一種使用上述制備方法制備的二氧化硅納米粒子的應(yīng)用。本申請(qǐng)制備的二氧化硅納米粒子因其粒徑均勻而集中，具有非常好的特性，可廣泛應(yīng)用于固定化酶

的載體，酶自固定化即是酶在一定條件下或者介質(zhì)中自發(fā)形成不可溶狀態(tài)酶的過程，例如

將ELP40與木聚糖酶融合表達(dá)，實(shí)現(xiàn)硅基的木聚糖酶的自固定化。再例如，仿生二氧化硅納

米粒子作為的緩釋藥物的載體等等。

[0100] 應(yīng)該強(qiáng)調(diào)，術(shù)語“包括/包含”在本文使用時(shí)指特征、要素、步驟或組件的存在，但并不排除一個(gè)或更多個(gè)其它特征、要素、步驟或組件的存在或附加。

[0101] 此外，本發(fā)明的方法不限于按照說明書中描述的時(shí)間順序來執(zhí)行，也可以按照其他的時(shí)間順序地、并行地或獨(dú)立地執(zhí)行。因此，本說明書中描述的方法的執(zhí)行順序不對(duì)本發(fā)

明的技術(shù)范圍構(gòu)成限制。

[0102] 盡管上面已經(jīng)通過對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施例的描述對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了披露，但是，應(yīng)該理解，上述的所有實(shí)施例和示例均是示例性的，而非限制性的。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可在所

附權(quán)利要求的精神和范圍內(nèi)設(shè)計(jì)對(duì)本發(fā)明的各種修改、改進(jìn)或者等同物。這些修改、改進(jìn)或

者等同物也應(yīng)當(dāng)被認(rèn)為包括在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。