權(quán)利要求

無(wú)

說(shuō)明書(shū)

技術(shù)領(lǐng)域

[0001]本發(fā)明涉及材料分析檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種功能性含氟納米磁珠的制備方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)

[0002]隨著蛋白質(zhì)組學(xué)的研究與質(zhì)譜儀的準(zhǔn)確性與靈敏度的提高，目前基于質(zhì)譜方法檢測(cè)PTMs已經(jīng)成為常用手段之一。然而如何實(shí)現(xiàn)快速、大量的檢測(cè)成了限制質(zhì)譜在蛋白組學(xué)中應(yīng)用的關(guān)鍵。常見(jiàn)的方法大多是利用生物素標(biāo)記法，通過(guò)親和分離以及純化進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)。然而在分離與純化的過(guò)程中，未反應(yīng)的生物素標(biāo)簽難以從捕獲樹(shù)脂中洗脫，且生物素標(biāo)簽在質(zhì)譜測(cè)試過(guò)程中會(huì)發(fā)生解離。導(dǎo)致在數(shù)據(jù)分析過(guò)程中觀(guān)察到大量的被解離的分子碎片，導(dǎo)致在鑒定低豐度物質(zhì)中產(chǎn)生的誤差較大。為了解決這一問(wèn)題的困擾，近年來(lái)提出了利用氟親和標(biāo)簽(Fluorousaffinitytag, FAT) 來(lái)代替生物素作為標(biāo)記物應(yīng)用于蛋白質(zhì)組學(xué)方法的開(kāi)發(fā)中。我們?cè)?TFIA作為標(biāo)簽實(shí)現(xiàn)對(duì)擬南芥體內(nèi)的S-亞硝基化修飾的肽段進(jìn)行定量檢測(cè)(參照文獻(xiàn)：1 Guochen Qin, Menghuan Qu, Bei Jia, Wei Wang, ZhoujunLuo, Chun-Peng Song, W. Andy Tao, Pengcheng Wang. FAT-switch-basedquantitative S-nitrosoproteomics reveals a key role of GSNOR1 in regulatingER functions. Nat. Commun., 2023, 14, 3268.)。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中選擇C18富集柱對(duì)含有TFIA標(biāo)簽的肽段進(jìn)行標(biāo)記，但由于C18富集柱無(wú)法實(shí)現(xiàn)特異性富集，因此導(dǎo)致富集效率穩(wěn)定性較差。

[0003]為了提高對(duì)含氟標(biāo)簽的特異性富集，也為了能夠更好的實(shí)現(xiàn)高通量、自動(dòng)化檢測(cè)。我們嘗試?yán)么胖檫@一廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的一種新型功能性材料實(shí)現(xiàn)提高富集效率、自動(dòng)化檢測(cè)的目標(biāo)。我們利用氟與氟之間的鍵合能力遠(yuǎn)強(qiáng)于氟與氫之間的鍵合能力的特點(diǎn)，嘗試將含氟硅烷與功能性磁珠結(jié)合，來(lái)構(gòu)建能夠批量的、特異性的富集含有氟標(biāo)簽的肽段的方法。

發(fā)明內(nèi)容

[0004]本發(fā)明的目的是針對(duì)以上問(wèn)題提供一種功能性含氟納米磁珠的制備方法及應(yīng)用，分別用于制備含氟納米磁珠、構(gòu)建富集含有氟標(biāo)簽的肽段的方法。

[0005]為達(dá)到上述目的，本發(fā)明公開(kāi)了一種功能性含氟納米磁珠的制備方法及應(yīng)用，該功能性含氟納米磁珠的制備方法包括如下步驟：步驟A100、利用二氧化硅包裹四氧化三鐵與含氟硅烷的偶聯(lián)反應(yīng)得到含有功能性含氟納米磁珠的混合物;步驟A200、對(duì)含有功能性含氟納米磁珠的混合物進(jìn)行清洗，得到功能性含氟納米磁珠。

[0006]進(jìn)一步的，所述二氧化硅包裹四氧化三鐵與含氟硅烷的偶聯(lián)反應(yīng)的結(jié)構(gòu)式表示如下：

[0007]進(jìn)一步的，所述步驟A100包括：步驟A101、將二氧化硅包裹四氧化三鐵溶于乙醇溶液中;步驟A102、加入含氟硅烷和氨水，二氧化硅包裹四氧化三鐵與含氟硅烷發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)，得到含有功能性含氟納米磁珠的混合物。

[0008]進(jìn)一步的，所述步驟A102中加入含氟硅烷和氨水后，觀(guān)察到分層現(xiàn)象后，在50oC下反應(yīng)至上方懸濁液澄清，下層氟相逐漸渾濁，得到含有功能性含氟納米磁珠的混合物。

[0009]進(jìn)一步的，所述步驟A200包括：步驟A201、含有功能性含氟納米磁珠的混合物在磁力作用下除掉上層乙醇相及下層氟相溶液;步驟A202、加入全氟辛烷洗滌，磁力作用下去除溶液;步驟A203、加水溶液洗滌，磁力作用下去除溶液;步驟A204、加入甲醇水混合溶液洗滌，磁力作用下去除溶液;步驟A205、加入甲醇溶液洗滌，磁力作用下去除溶液;步驟A206、吹干得到功能性含氟納米磁珠。

[0010]本發(fā)明還公開(kāi)了一種功能性含氟納米磁珠的應(yīng)用方式，該功能性含氟納米磁珠由二氧化硅包裹四氧化三鐵與含氟硅烷的偶聯(lián)反應(yīng)得到，該功能性含氟納米磁珠用于富集含有氟標(biāo)簽的肽段。

[0011]優(yōu)選的，所述功能性含氟納米磁珠通過(guò)以上所述的方法制備得到。

[0012]進(jìn)一步的，功能性含氟納米磁珠的應(yīng)用包括如下步驟：步驟B100、用氟標(biāo)簽標(biāo)記蛋白質(zhì);步驟B200、用FASP方法酶解蛋白質(zhì);步驟B300、用功能性含氟納米磁珠富集氟標(biāo)簽標(biāo)記肽段，洗脫并收集富集后的肽段;步驟B400、利用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜對(duì)收集到的肽段進(jìn)行檢測(cè)。

[0013]進(jìn)一步的，所述步驟B100包括：將待測(cè)蛋白質(zhì)置于離心管中加入氟標(biāo)簽化合物對(duì)目標(biāo)肽段進(jìn)行標(biāo)記，反應(yīng)結(jié)束后采用FASP方法進(jìn)行酶解;

進(jìn)一步的，所述步驟B200包括：碳酸氫銨溶液置換洗滌，重復(fù)多次;加入酶進(jìn)行酶解反應(yīng);加入酸溶液終止酶解反應(yīng)，離心后上層清液通過(guò)真空濃縮處理。

[0014]進(jìn)一步的，所述步驟B300包括：將功能性含氟納米磁珠與肽段溶液混合;孵育后在磁力作用下分離功能性含氟納米磁珠與溶液;用緩沖溶液和有機(jī)溶劑的混合溶液洗滌功能性含氟納米磁珠;用有機(jī)溶劑洗脫功能性含氟納米磁珠上的肽段。

[0015]綜上所述，本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明所制備的功能性含氟納米磁珠實(shí)現(xiàn)了對(duì)肽段的高效、特異性富集，解決了傳統(tǒng)生物素標(biāo)記法中未反應(yīng)標(biāo)簽難以洗脫及標(biāo)簽解離導(dǎo)致質(zhì)譜分析誤差的問(wèn)題，通過(guò)應(yīng)用該功能性含氟納米磁珠實(shí)現(xiàn)了高通量、自動(dòng)化檢測(cè)，為蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供了一種重要手段。

附圖說(shuō)明

[0016]圖1是本發(fā)明中功能性含氟納米磁珠的粒徑圖。

具體實(shí)施方式

[0017]以下結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明，但本發(fā)明不受下列實(shí)施例的限定。

[0018]本發(fā)明公開(kāi)了功能性含氟納米磁珠制備方法的一種實(shí)施例，具體步驟如下。

[0019]步驟1：功能性含氟納米磁珠 1的合成制備

將5 mg二氧化硅包裹四氧化三鐵 (Fe3O4@SiO2) 溶于1 mL乙醇溶液中。依次加入1H,1H,2H,2H-全氟辛基三乙氧基硅烷(PFTS)與1.5 mL氨水后觀(guān)察到明顯的分層現(xiàn)象。上層為二氧化硅包裹四氧化三鐵(Fe3O4@SiO2) 的懸濁液，下層為1H,1H,2H,2H-全氟辛基三乙氧基硅烷 (PFTS) 溶液。在50oC條件下反應(yīng)至上方懸濁液澄清，下層氟相逐漸渾濁，說(shuō)明已經(jīng)生成了功能性含氟納米磁珠1 (Fe3O4@SiO2@PFTS)。

[0020]步驟2：功能性含氟納米磁珠的清洗

將離心管放置在磁力架上靜置5 min后用移液槍吸取上層乙醇相及下層氟相溶液。

[0021]撤去磁力架后，加入200 μL全氟辛烷洗滌，5 min后重新放置在磁力架上靜置5min后用移液槍吸去溶液，丟棄掉該溶液，重復(fù)該操作2-3次。

[0022]加入200 μL水溶液洗滌，5 min后重新放置在磁力架上靜置5 min后用移液槍吸去溶液，丟棄掉該溶液，重復(fù)該操作2-3次。

[0023]加入200 μL甲醇水混合溶液洗滌，5 min后重新放置在磁力架上靜置5 min后用移液槍吸去溶液，丟棄掉該溶液，重復(fù)該操作2-3次。

[0024]加入200μL甲醇溶液洗滌，5 min后重新放置在磁力架上靜置5 min后用移液槍吸去溶液，丟棄掉該溶液，重復(fù)該操作2-3次。用N2吹干，備用。

[0025]由此制備出適用于富集氟標(biāo)簽標(biāo)記肽段的功能性含氟納米磁珠，圖1為功能性含氟納米磁珠的粒徑圖。

[0026]該方法適用于多種含氟硅烷與不同尺寸的功能性納米磁珠的制備，所制備出的功能性含氟納米磁珠可以用于富集含有氟標(biāo)簽的肽段。

[0027]本發(fā)明還公開(kāi)了功能性含氟納米磁珠的用于富集氟標(biāo)簽的肽段的兩種實(shí)施例。

實(shí)施例1

[0028]5 mg 二氧化硅包裹四氧化三鐵(Fe3O4@SiO2)與50mg 1H,1H,2H,2H-全氟辛基三乙氧基硅 (PFTS) 遵循前述氟納米磁珠制備方法得到功能性含氟納米磁珠1 (Fe3O4@SiO2@PFTS)。

[0029]用氟標(biāo)簽N-[(3-全氟己基)-丙基]-碘乙酰胺 (TFIA) 標(biāo)記牛血清蛋白 (BSA)。200 μg BSA (1mg/mL) 置于10KDa的濾膜中，溶于10 mM 三-(2-甲酰乙基)膦鹽酸鹽(TCEP) 中，在37oC條件下反應(yīng)1h;

加入700 μg TFIA，室溫下避光處理2h后離心，除去未反應(yīng)的TFIA;

加入200 μL碳酸氫銨溶液 (50 mM) 置換洗滌，重復(fù)3次。

[0030]按照1:50比例加入胰蛋白酶 (500 μL體系)，37℃搖床中孵育過(guò)夜 (13-16h);

加入10%甲酸水溶液終止酶解反應(yīng)，離心后上層清液通過(guò)真空濃縮后標(biāo)記為樣品-TFIA備用;

含氟納米磁珠1富集氟標(biāo)簽標(biāo)記肽段:取5 mg含氟納米磁珠1 與樣品-TFIA分別溶于200 μL 50% 25 mM碳酸氫銨50%甲醇混合溶液。混合均勻后，在24oC,600rpm條件下,孵育10min后取出放置磁力架上靜置5 min后，丟棄溶液;

200 μL 25 mM碳酸氫銨動(dòng)作輕柔的將磁珠充分打散清洗，靜置在磁力架5 min后，丟棄溶液;

200 μL 60% 25 mM碳酸氫銨40%甲醇混合溶液洗滌，將磁珠充分打散清洗，靜置在磁力架5min后，丟棄溶液;

40 % 25 mM碳酸氫銨60%甲醇混合溶液洗滌，將磁珠充分打散清洗，靜置在磁力架5 min后，丟棄溶液;

用200 μL甲醇溶液通過(guò)離心的方法洗脫后收集溶液，后凍干備用。

[0031]凍干后的樣品溶于7 μL溶樣液(5%乙腈0.2%甲酸水溶液) 后利用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜 (LC-MS/MS) 測(cè)試。分析數(shù)據(jù)后得到該方法富集到含有氟標(biāo)簽標(biāo)記的肽段量為82，總肽段量為137，富集效率為60%。

實(shí)施例2

[0032]5mg 二氧化硅包裹四氧化三鐵(Fe3O4@SiO2)與50 mg 1H,1H,2H,2H-全氟己基三乙氧基硅烷(TFPS)遵循前述氟納米磁珠制備方法得到功能性含氟納米磁珠2 (Fe3O4@SiO2@TFPS)。

[0033]用氟標(biāo)簽2-碘-N-(4,4,5,5,6,6,7,7,7-九氟庚基)乙酰胺 (NFIA) 標(biāo)記牛血清蛋白BSA。200 μg BSA (1mg/mL) 置于10KDa的濾膜中，溶于10 mM 三-(2-甲酰乙基)膦鹽酸鹽TCEP 中，在37oC條件下反應(yīng)1h;

加入700 μg NFIA，室溫下避光處理2 h后離心，除去未反應(yīng)的NFIA;

加入200 μL碳酸氫銨溶液 (50 mM) 置換洗滌，重復(fù)3次。

[0034]按照1:50比例加入胰蛋白酶 (500 μL體系)，37oC搖床中孵育過(guò)夜 (13-16h);

加入10%甲酸水溶液終止酶解反應(yīng)，離心后上層清液通過(guò)真空濃縮后標(biāo)記為樣品-NFIA備用;

含氟納米磁珠2富集氟標(biāo)簽標(biāo)記肽段。

[0035]取5 mg含氟納米磁珠2與樣品-NFIA分別溶于200 μL 50% 25 mM碳酸氫銨50%甲醇混合溶液，混合均勻后，在24oC,600rpm條件下,孵育10 min后取出放置磁力架上靜置5 min后，丟棄溶液;

200μL 25 mM碳酸氫銨動(dòng)作輕柔的將磁珠充分打散清洗，靜置在磁力架5min后，丟棄溶液;

200μL 60% 25 mM碳酸氫銨40%甲醇混合溶液洗滌，將磁珠充分打散清洗，靜置在磁力架5 min后，丟棄溶液;

40% 25 mM碳酸氫銨60%甲醇混合溶液洗滌，將磁珠充分打散清洗，靜置在磁力架5min后，丟棄溶液;

用200 μL甲醇溶液通過(guò)離心的方法洗脫后收集溶液，后凍干備用。

[0036]凍干后的樣品溶于7 μL溶樣液(5%乙腈0.2%甲酸水溶液) 后利用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜 (LC-MS/MS) 測(cè)試。分析數(shù)據(jù)后得到該方法富集到含有氟標(biāo)簽標(biāo)記的肽段量為97，總肽段量為150，富集效率為65%。

[0037]以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和替換，這些改進(jìn)和替換也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。

說(shuō)明書(shū)附圖(1)