權利要求

1.電化學生物傳感器，包括絲網(wǎng)印刷工作電極，其特征在于，所述絲網(wǎng)印刷工作電極表面依次修飾有酸性碳納米管、交聯(lián)劑及穩(wěn)定劑。

2.一種電化學生物傳感器的制備方法，其特征在于，包括以下步驟： (1)將碳納米管放入濃硫酸和濃硝酸混合溶液中，油浴后，用水進行抽濾，加入乙醇后進行旋蒸，得到酸化碳納米管； (2)對酸化碳納米管進行稀釋，滴涂在絲網(wǎng)印刷工作電極表面上，干燥處理； (3)使用交聯(lián)劑孵育步驟(2)制備的絲網(wǎng)印刷工作電極，對酸化碳納米管進行活化，以交聯(lián)抗體； (4)將抗體滴涂在步驟(3)制備的絲網(wǎng)印刷工作電極上，進行孵育； (5)在步驟(4)制備的絲網(wǎng)印刷工作電極上，滴加穩(wěn)定劑孵育，封閉所述絲網(wǎng)印刷工作電極上未反應的活性位點，得到電化學生物傳感器。 

3.根據(jù)權利要求2所述的一種電化學生物傳感器的制備方法，其特征在于，步驟(1)中，濃硫酸和濃硝酸的摩爾比為3：1；油浴溫度為120℃，油浴時間為2h；旋蒸時間為15分鐘。 

4.根據(jù)權利要求2所述的一種電化學生物傳感器的制備方法，其特征在于，步驟(2)中，采用乙醇對酸性碳納米管進行稀釋，乙醇濃度為25ug/ml；采用紅外燈進行干燥處理。 5.根據(jù)權利要求2所述的一種電化學生物傳感器的制備方法，其特征在于，所述步驟(3)中的交聯(lián)劑為1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)。 

6.根據(jù)權利要求2所述的一種電化學生物傳感器的制備方法，其特征在于，所述步驟(3)中交聯(lián)劑的孵育時間為30min。 

7.根據(jù)權利要求2所述的一種電化學生物傳感器的制備方法，其特征在于，步驟(4)中，抗體的孵育時間為1h。 

8.根據(jù)權利要求2所述的一種電化學生物傳感器的制備方法，其特征在于，所述穩(wěn)定劑為牛血清白蛋白溶液。 

9.根據(jù)權利要求8所述的一種電化學生物傳感器的制備方法，其特征在于，所述牛血清白蛋白溶液的質量分數(shù)1％牛血清白蛋白溶液，孵育時間為30min。 10.如權利要求1所述的電化學生物傳感器在新型冠狀病毒檢測中的應用。

說明書

技術領域

本發(fā)明涉及電化學分析檢測領域，尤其是涉及一種電化學生物傳感器及其制備方法與應用。

背景技術

新冠病毒又稱之為新型冠狀病毒，傳染性非常強，為遏制新型冠狀病毒傳染，新型冠狀病毒抗原的檢測尤為重要，現(xiàn)有技術中主要采用以下技術進行新型冠狀病毒抗原的檢測：

基于高通量測序平臺的SARS-CoV-2核酸檢測技術：高通量測序平臺的最大優(yōu)點是可以發(fā)現(xiàn)未知病原體并獲得完整的基因序列，因此，它非常適合在疫情爆發(fā)的早期識別病原體，并為病原體核酸檢測技術的進一步發(fā)展提供序列信息，然而，當高通量測序平臺用于病原體檢測時，由于測序儀器昂貴、檢測周期長和檢測成本高，往往難以普及。

基于實時PCR平臺的新型冠狀病毒核酸檢測技術：實時熒光定量PCR平臺可以通過一個緊湊的實時熒光定量PCR儀器實現(xiàn)對已知序列的靶核酸的靈敏和定量檢測。實時PCR平臺因其穩(wěn)定性、可靠性和易操作性，已成為應用最廣泛的核酸檢測平臺。由于實時PCR平臺具有靈敏度高、特異性好、操作簡單等優(yōu)點，且大型醫(yī)療機構普遍配備相關儀器，是目前用于新型冠狀病毒核酸檢測的主要技術平臺。然而，核酸提取和擴增檢測通常在傳統(tǒng)實時PCR平臺中單獨進行，需要高度專業(yè)化的實驗室和訓練有素的操作員。此外，實時PCR平臺依賴熒光定量PCR儀器，檢測時間為2-4小時，不適合在資源有限的地區(qū)進行現(xiàn)場篩查和檢測。由于檢測靈敏度不足以檢測病毒載量低的樣本，且受熒光標記種類的限制，單個拷貝的tar數(shù)量較多，因此經(jīng)常出現(xiàn)假陰性結果。

專利申請?zhí)枮?02110888055.0的發(fā)明專利公開了一種電化學生物傳感器及其制備方法和檢測新型冠狀病毒的方法：其公開的電化學生物傳感器包括絲網(wǎng)印刷電極和修飾在絲網(wǎng)印刷電極表面的功能層，功能層含有聚丙烯胺鹽酸鹽(PAH)、二氧化鈰(CeO2)以及二茂鐵標記的非特異性單鏈DNA(Fc-ssDNA)，其以絲網(wǎng)印刷電極作為基體，以二茂鐵標記的非特異性單鏈DNA(Fc-ssDNA)作為電化學探針，然而其在檢測時，需要對相應的DNA進行標記，操作繁瑣且成本較高。

發(fā)明內容

為解決上述技術問題，本發(fā)明提供一種電化學生物傳感器及其制備方法與應用。

本申請實施例的第一方面提供了一種電化學生物傳感器，包括絲網(wǎng)印刷工作電極，所述絲網(wǎng)印刷工作電極表面依次修飾有酸性碳納米管、交聯(lián)劑及穩(wěn)定劑。

本申請的第二方面提供了一種電化學生物傳感器的制備方法，包括以下步驟：

(1)將碳納米管放入濃硫酸和濃硝酸混合溶液中，油浴后，用水進行抽濾，加入乙醇后進行旋蒸，得到酸化碳納米管；

(2)對酸化碳納米管進行稀釋，滴涂在絲網(wǎng)印刷工作電極表面上，干燥處理；

(3)使用交聯(lián)劑孵育步驟(2)制備的絲網(wǎng)印刷工作電極，對酸化碳納米管進行活化，以交聯(lián)抗體；

(4)將抗體滴涂在步驟(3)制備的絲網(wǎng)印刷工作電極上，進行孵育；

(5)在步驟(4)制備的絲網(wǎng)印刷工作電極上，滴加穩(wěn)定劑孵育，封閉所述絲網(wǎng)印刷工作電極上未反應的活性位點，得到電化學生物傳感器。

在其中一實施例中，步驟(1)中，濃硫酸和濃硝酸的摩爾比為3：1；油浴溫度為120℃，油浴時間為2h；旋蒸時間為15分鐘。

在其中一實施例中，步驟(2)中，采用乙醇對酸性碳納米管進行稀釋，乙醇濃度為25ug/ml；采用紅外燈進行干燥處理。

在其中一實施例中，所述步驟(3)中的交聯(lián)劑為1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)。

在其中一實施例中，所述步驟(3)中交聯(lián)劑的孵育時間為30min。

在其中一實施例中，步驟(4)中，抗體的孵育時間為1h。

在其中一實施例中，所述穩(wěn)定劑為牛血清白蛋白溶液。

在其中一實施例中，所述牛血清白蛋白溶液的質量分數(shù)1％牛血清白蛋白溶液，孵育時間為30min。

本申請的第三方面提供了一種電化學生物傳感器在新型冠狀病毒檢測中的應用。

本發(fā)明使用酸化碳納米管修飾絲網(wǎng)印刷工作電極，通過對碳納米管進行酸化，可以增強其活性并去除雜質，使其含有大量羧基，采用交聯(lián)劑對酸化碳納米管中羧基進行活化，以交聯(lián)抗體。本申請?zhí)岢龅碾娀瘜W生物傳感器制作方法有便攜、靈敏、穩(wěn)定性高、小型化、成本低、無需前處理、檢測快速等優(yōu)點，可實現(xiàn)對新型冠狀病毒肺炎患者的早發(fā)現(xiàn)、早隔離及早治療，同時為設計現(xiàn)場快速診斷新型冠狀病毒檢測設備提供有力支撐。

附圖說明

圖1為本申請一實施例提供的一種電化學生物傳感器的制備流程示意圖；

圖2為本申請一實施例提供的電化學工作站的結構示意圖；

圖3為本申請一實施例提供的抗原濃度與交流阻抗的關系圖。

具體實施方式

為了使本申請所要解決的技術問題、技術方案及有益效果更加清楚明白，以下結合附圖及實施例，對本申請進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本申請，并不用于限定本申請。

除非另有定義，本發(fā)明所使用的所有的技術和科學術語與屬于本發(fā)明的技術領域的技術人員通常理解的含義相同。本發(fā)明的說明書中所使用的術語只是為了描述具體的實施例的目的，不用于限制本發(fā)明。

本發(fā)明的術語“包括”和“具有”以及它們任何變形，意圖在于覆蓋不排他的包含。例如包含了一系列步驟的過程、方法、裝置、產(chǎn)品或設備沒有限定于已列出的步驟或模塊，而是可選地還包括沒有列出的步驟，或可選地還包括對于這些過程、方法、產(chǎn)品或設備固有的其它步驟。

本實施例的第一方面提供了一種電化學生物傳感器，包括絲網(wǎng)印刷工作電極，絲網(wǎng)印刷工作電極表面依次修飾有酸化碳納米管、交聯(lián)劑及穩(wěn)定劑。

具體地，絲網(wǎng)印刷工作電極采用碳電極，碳電極具有寬電位窗口、低背景和易于表面修飾等特點廣泛應用于電化學傳感器，在碳電極表面進行電化學預處理，提供了一種低成本和簡易的方法來改善傳感器的電化學行為。

酸化碳納米管由碳納米管制備而成，碳納米管是生物傳感器中高度優(yōu)選的材料，其具有高靈敏度、低噪聲和寬吸收光譜，操作簡單等特點，是實時監(jiān)測中最理想的；且碳納米管是碳的重要多晶型形式，因其具有優(yōu)異的電子轉移性能、機械性能和優(yōu)異的生物相容性，使其成為制造傳感器電極的優(yōu)良碳基材料。

此外，碳納米管可以提供很大的電活性區(qū)域，可以幫助同時感應許多分子，碳納米管的獨特性質使其成為適用于電化學生物傳感器轉導機制的出色導電納米級電極材料，與其他也用作電化學生物傳感器表面修飾劑的材料(如金和銀)相比，快速、綠色的獲得方式，這種材料的大比表面積允許感興趣的生物分子耦合，并且可以增強其導電性，用固定劑將其功能化，并且這種類型的表面修飾可以很容易地轉移到絲網(wǎng)印刷碳電極上，使得這種免疫傳感器能夠集成在編寫檢測設備中。本實施例將碳納米管進行酸化，可以增強其活性及去除雜質，使其含有大量羧基，便于通過交聯(lián)劑偶聯(lián)抗體。

交聯(lián)劑為1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，EDC—NHS聯(lián)用可以對酸化碳納米管羧基進行活化，以交聯(lián)抗體。

穩(wěn)定劑為牛血清白蛋白溶液，通過牛血清白蛋白溶液封閉絲網(wǎng)印刷工作電極上未反應的活性位點，以得到電化學生物傳感器。

如圖1所示，本實施例的第二方面提供了一種電化學生物傳感器的制備方法，包括以下步驟：

步驟(1)：將500mg碳納米管放入90ml濃硫酸和30ml濃硝酸混合溶液中，在120℃的溫度下油浴，油浴時間為2h；油浴后，用水進行抽濾，加入乙醇后旋蒸15分鐘，將水和乙醇混合物溶劑全部蒸干，得到酸化碳納米管，以在碳納米管的壁上引入羧基；

步驟(2)：將酸化碳納米管用乙醇進行稀釋，乙醇濃度為25ug/ml，滴涂10ul在絲網(wǎng)印刷工作電極表面上，用紅外燈烘干20分鐘；

步驟(3)：滴加5ul 100mM的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺(EDC)在步驟(2)制備的絲網(wǎng)印刷工作電極上孵育15min，然后滴加5ul 25mM的N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)繼續(xù)孵育15min，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDC)使羥基和氨基間脫水形成酰胺鍵，酸化碳納米管上的羧基先與EDC反應生成一個中間物，然后再與抗體上的氨基反應，形成酸化碳納米管與抗體蛋白質的結合物，N-羥基琥珀酰亞胺NHS與EDC交聯(lián)使用，可以起到增大活化羧基性能和增強穩(wěn)定性的作用，EDC—NHS聯(lián)用對酸化碳納米管進行活化，以交聯(lián)抗體；

步驟(4)：將10ul抗體滴涂在步驟(3)制備的絲網(wǎng)印刷工作電極上，孵育1h；

步驟(5)：在步驟(4)制備的絲網(wǎng)印刷工作電極上，滴加10ul質量分數(shù)1％牛血清白蛋白溶液，孵育30min，封閉電極上未反應的活性位點，得到制備好的電化學生物傳感器，將電化學生物傳感器浸泡在PH為7.4的磷酸鹽緩沖液中儲存?zhèn)溆谩?/span>

本申請的第三方面提供了一種電化學生物傳感器在新型冠狀病毒檢測中的應用。

將上述實施例制備得到的電化學生物傳感器孵育新型冠狀病毒抗原，孵育30min，利用電化學工作站測量交流阻抗(EIS)的變化。

具體地，如圖2所示，將上述實施例制備得到的電化學生物傳感器作為工作電極，銀/氯化銀作為參比電極，碳作為輔助電極，建立電化學工作站。

本實施例中所用抗體名稱：2019-nCOV NP Antibody(5A6)、抗體原液濃度：6.48mg/ml、分子質量：150KD；所用抗原名稱：2019-nCOV Antigen(NCPN2)、抗原原液濃度：0.27mg/ml、分子質量：62KD。

如圖3所示，測量上述實施例制備得到的電化學生物傳感器交流阻抗的變化，可以根據(jù)半圓直徑大小判斷交流阻抗大小，直徑越大，交流阻抗越大；曲線A的電化學生物傳感器未滴加抗原，曲線B的電化學生物傳感器滴加10uL濃度為0.1ug/mL抗原；曲線C的電化學生物傳感器滴加10uL濃度為1ug/mL抗原；曲線D的電化學生物傳感器10uL濃度為10ug/mL抗原，由圖可知，隨抗原濃度的增加，電化學生物傳感器所測得的交流阻抗逐漸增大。

綜上所述，本申請實施例提供的電化學生物傳感器，是一種無需對樣品進行預處理或標記的高靈敏免疫學診斷方法，該傳感器可由平板計算機或智能手機中的軟件連接便攜式恒電位儀，不需要大型檢測設備，在試劑成本及檢測成本、操作人員專業(yè)技能要求、檢測時間等方面仍具有相當優(yōu)勢，且檢測時間短，不需要專業(yè)人員進行幫助測定，便于普及。本申請?zhí)岢龅?a href="http://frjcc.com/tech_show-2716.html" target="_blank">電化學生物傳感器制作方法有便攜、靈敏、穩(wěn)定性高、小型化、成本低、無需前處理、檢測快速等優(yōu)點，可實現(xiàn)對新型冠狀病毒肺炎患者的早發(fā)現(xiàn)、早隔離及早治療，同時為設計現(xiàn)場快速診斷新型冠狀病毒檢測設備提供有力支撐。

本領域普通技術人員可以意識到，結合本文中所公開的實施例描述的各示例的單元及算法步驟，能夠以電子硬件、或者計算機軟件和電子硬件的結合來實現(xiàn)。這些功能究竟以硬件還是軟件方式來執(zhí)行，取決于技術方案的特定應用和設計約束條件。專業(yè)技術人員可以對每個特定的應用來使用不同方法來實現(xiàn)所描述的功能，但是這種實現(xiàn)不應認為超出本申請的范圍。

以上所述實施例僅用以說明本申請的技術方案，而非對其限制；盡管參照前述實施例對本申請進行了詳細的說明，本領域的普通技術人員應當理解：其依然可以對前述各實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分技術特征進行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應技術方案的本質脫離本申請各實施例技術方案的精神和范圍，均應包含在本申請的保護范圍之內。

電化學生物傳感器及其制備方法與應用.pdf