土壤中雙酚a及其十三種結(jié)構(gòu)類似物的同步測(cè)定方法

技術(shù)領(lǐng)域

1.本發(fā)明屬于新型有機(jī)污染物的檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及為一種加速溶劑萃取結(jié)合超高效液相色譜?串聯(lián)質(zhì)譜同時(shí)測(cè)定土壤中雙酚a及其結(jié)構(gòu)類似物的方法。

背景技術(shù)：

2.近幾十年來(lái)，雙酚a(bisphenol a，bpa)這種被廣泛使用的酚類塑化劑，被大量用于聚碳酸酯塑料、環(huán)氧樹脂和酚醛樹脂的生產(chǎn)，被用于制造各種消費(fèi)品，如塑料食品包裝產(chǎn)品、罐襯里、嬰兒奶瓶、醫(yī)用管、眼鏡鏡片以及熱敏紙等。作為一種典型的內(nèi)分泌干擾物質(zhì)(edc)，bpa通過(guò)模擬干擾荷爾蒙活性，破壞生長(zhǎng)、發(fā)育和繁殖，對(duì)生態(tài)系統(tǒng)和人體健康產(chǎn)生不利影響。也有報(bào)道稱bpa可以干擾苜蓿和根瘤菌之間的信號(hào)傳導(dǎo)，導(dǎo)致固氮能力下降。大量的結(jié)構(gòu)類似物隨著對(duì)bpa使用監(jiān)管的加強(qiáng)被當(dāng)作其替代品。比如雙酚s(bisphenol s，bps)是bpa熱敏紙以及環(huán)氧樹脂生產(chǎn)中的替代品，雙酚af(bisphenol af，bpaf)、雙酚f(bisphenol f，bpf)在聚碳酸酯的生產(chǎn)中被用作替代品，雙酚b(bisphenol b，bpb)在酚醛樹脂的生產(chǎn)中被用作替代品。這些替代品因?yàn)榕cbpa具有相似的結(jié)構(gòu)而具有類似的理化性質(zhì)和毒理學(xué)特征，也會(huì)和bpa一樣對(duì)生態(tài)系統(tǒng)和人類健康造成威脅。

3.目前，已經(jīng)在水體、污泥、灰塵等環(huán)境介質(zhì)中廣泛檢測(cè)到雙酚的存在，但是沒(méi)有涉及到土壤中多種雙酚類似物的定量研究。而土壤作為bpa及其類似物的重要的匯，它們可能通過(guò)直接廢水排放、污泥施用、相關(guān)固體廢物的處置和回收以及塑料農(nóng)膜的使用等方式進(jìn)入土壤，對(duì)土壤生態(tài)產(chǎn)生影響，并經(jīng)食物鏈對(duì)人類健康造成危害。此外，隨著化學(xué)工業(yè)繼續(xù)開發(fā)更多的雙酚a替代品，在監(jiān)測(cè)項(xiàng)目中增加雙酚類化合物的數(shù)量是必要的。因此，需要對(duì)土壤中多種雙酚進(jìn)行準(zhǔn)確定量，然而，由于土壤介質(zhì)相對(duì)比較復(fù)雜，且雙酚在土壤樣品中的濃度多處于痕量或超痕量水平，對(duì)于它們的準(zhǔn)確定量分析成為研究的難點(diǎn)，目前為止，也沒(méi)有相關(guān)分析方法的發(fā)表。

4.目前最常用的提取土壤中有機(jī)物的方法有超聲提取法(ultrasound extraction，use)、索氏提取法(soxhlet extraction)、固液萃取法(solid fluid extraction，sle)、加速溶劑萃取法(accelerated solvent extraction，ase)等。但是土壤中含有大量腐殖質(zhì)、各種污染物以及色素，這將會(huì)嚴(yán)重?fù)p傷儀器設(shè)備，還將影響目標(biāo)物質(zhì)的檢測(cè)。因此，樣品提取后需要進(jìn)行凈化處理，常見的技術(shù)手段有在線凈化(purify online)和固相萃取(solid phase extraction，spe)。痕量有機(jī)物的定量通常用到氣相色譜?質(zhì)譜法(gas chromatography?mass spectrometry，gc?ms)，氣相色譜?串聯(lián)質(zhì)譜法(gas chromatography?tandem mass spectrometry，gc?ms/ms)，液相色譜?質(zhì)譜法(liquid chromatography?mass spectrometry，lc?ms)，液相色譜?
串聯(lián)質(zhì)譜法(liquid chromatography?tandem mass spectrometry，lc?ms/ms)等。由于一組結(jié)構(gòu)類似物具有相似的理化性質(zhì)，因此進(jìn)行定量分析時(shí)如何將其完全色譜分離是技術(shù)難點(diǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

5.本發(fā)明要解決的問(wèn)題是提供一種同時(shí)提取、同時(shí)凈化以及同時(shí)檢測(cè)土壤樣品中雙酚a及其13種結(jié)構(gòu)類似物的一體化方法，旨在節(jié)約檢測(cè)的時(shí)間成本和經(jīng)濟(jì)成本，對(duì)于該類有機(jī)物在土壤介質(zhì)中的定量以及后續(xù)相關(guān)研究具有重要意義。

6.為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供一種土壤中雙酚a及其十三種結(jié)構(gòu)類似物的同步測(cè)定方法(即，使用加速溶劑萃取結(jié)合超高效液相色譜?串聯(lián)質(zhì)譜同步高效測(cè)定土壤中雙酚a及13種結(jié)構(gòu)類似物的方法，可同時(shí)快速分析土壤中14種雙酚類物質(zhì)的uplc?ms/ms定量方法)，包括如下步驟：

7.(1)樣品制備：

8.收集的土壤樣品除雜混勻后進(jìn)行干燥脫水(至含水率小于1％)，過(guò)篩，備用；

9.具體為：過(guò)2mm篩，然后用研缽和研棒研磨至過(guò)100目篩的均勻粉末，置于琥珀色玻璃小瓶中保存在4℃條件下備用；

10.(2)樣品提取及凈化：

11.2.1)、稱取1克步驟(1)土壤進(jìn)行加速溶劑萃取，并進(jìn)行在線凈化，得到提取液；

12.2.2)、將提取液濃縮至0.5

±

0.1ml，并用甲醇定容至1

±

0.1ml，得濃縮液；

13.2.3)、使用超速離心機(jī)對(duì)濃縮液進(jìn)行離心除去微小的雜質(zhì)，收集上清液；

14.(3)樣品檢測(cè)：將上清液中的土壤中雙酚a及其十三種結(jié)構(gòu)類似物(簡(jiǎn)稱14種雙酚)用超高效液相色譜

?

串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行定性定量分析。

15.其中，根據(jù)色譜峰保留時(shí)間、目標(biāo)物的特征離子以及其豐度比進(jìn)行定性，加入進(jìn)樣內(nèi)標(biāo)定量。

16.除了雙酚a(bisphenol a，bpa)之外，13種雙酚a的結(jié)構(gòu)類似物為：雙酚p(bisphenol p，bpp)、雙酚m(bisphenol m，bpm)、雙酚af(bisphenol af，bpaf)、雙酚e(bisphenol e，bpe)、雙酚ph(bisphenol ph，bpph)、雙酚ap(bisphenol ap，bpap)、雙酚f(bisphenol f，bpf)、雙酚s(bisphenol s，bps)、雙酚b(bisphenol b，bpb)、雙酚fl(bisphenol fl，bpfl)、雙酚tmc(bisphenol tmc，bp

?

tmc)、雙酚bp(bisphenol bp，bpbp)、雙酚z(bisphenol z，bpz)。

17.作為本發(fā)明的方法的改進(jìn)：

18.所述步驟(1)中的干燥為冷凍干燥，即土壤樣品干燥是在labconco真空冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行的。

19.作為本發(fā)明的方法的進(jìn)一步改進(jìn)：

20.所述步驟2.1)中：加速溶劑萃取過(guò)程中需使用34ml的不銹鋼萃取池，在其底部墊入cellulose ase萃取膜，從底部向上依次填入2g硅藻土，3g中性氧化鋁，空白土壤和硅藻土等質(zhì)量比的混合物，用量2g(防止土壤板結(jié))，加入混合標(biāo)樣(100ng g

?1)和氘代內(nèi)標(biāo)(100ng g

?1)，最后用石英砂鋪滿萃取池；

21.用甲醇

?

丙酮酸性混合溶劑作加速溶劑萃取的萃取劑，萃取過(guò)程在以下條件下運(yùn)行：80

?

150℃，1500psi平衡壓力，加熱時(shí)間5

?

7min，靜態(tài)提取時(shí)間5min，2

?

5個(gè)循環(huán)，漂洗量60％和吹掃時(shí)間100s；

22.甲醇

?

丙酮酸性混合溶劑，即，甲醇/丙酮(1/1，v/v)+1％甲酸，制備方法為：甲醇和丙酮按1/1的體積比混合，然后加入上述混合液體積1％的甲酸作為添加劑；

23.每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)，最后結(jié)果取平均值，減少系統(tǒng)誤差。

24.作為本發(fā)明的方法的進(jìn)一步改進(jìn)：

25.所述步驟2.2)中，濃縮方法為減壓旋蒸濃縮，將加速溶劑萃取后收集到的提取液在heidolph旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中55℃的水浴中減壓旋蒸濃縮至0.5

±

0.1ml，然后用甲醇定容至1

±

0.1ml。

26.作為本發(fā)明的方法的進(jìn)一步改進(jìn)：

27.所述步驟2.3)中，將濃縮液倒入2

?

ml離心管中，在超速離心機(jī)中以2500g的速度離心10min后，取上清液至waters自動(dòng)進(jìn)樣器樣品瓶中，以待后續(xù)定量。

28.作為本發(fā)明的方法的進(jìn)一步改進(jìn)：

29.所述步驟(3)中，液相色譜的條件為：

30.液相色譜柱：acquity beh phenyl(2.1mm

×

100mm，1.7μm)；柱溫40℃；

31.在二元溶劑管理器前，使用較短的uplc色譜柱(acquity beh c18，2.1mm

×

50mm，1.7μm)作為捕集柱，消除儀器和流動(dòng)相中可能存在的本底干擾；

32.流動(dòng)相：a相為超純水，b相為甲醇，二者均為hplc級(jí)，并且均加入了體積分?jǐn)?shù)0.1％的氨水作添加劑；即，a相為在超純水中加入占超純水體積0.1％的氨水，b相為在甲醇中加入占甲醇體積0.1％的氨水；氨水是指含氨25％～28％的水溶液；

33.流速為0.2ml min

?1；

34.流動(dòng)相的洗脫梯度為：0

?

2min，40％b；2

?

3.5min，40％b

?

100％b；3.5

?

9min，維持100％b；9

?

9.1min，重新平衡至40％b；9.1

?

10min，維持40％b；

35.樣品進(jìn)樣量為5μl；

36.質(zhì)譜條件為：負(fù)電荷電噴霧離子源(esi

?

)；毛細(xì)管電壓為1.47kv；源溫度150℃；去溶劑氣溫度400℃；去溶劑氣流量為1000l h

?1；錐氣流量150l h

?1；碰撞氣體為0.15ml min

?1的氬氣；采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(mrm)進(jìn)行定量分析。

37.在本發(fā)明中：

38.1、通過(guò)優(yōu)化土壤中雙酚a及其13種結(jié)構(gòu)類似物的萃取方法，同時(shí)綜合考慮回收效率、時(shí)間、耗材及人力成本，本發(fā)明最終選擇加速溶劑萃取作為同時(shí)提取14種雙酚的方法；

39.2、通過(guò)優(yōu)化土壤中雙酚a及其13種結(jié)構(gòu)類似物的凈化方法，同時(shí)綜合考慮回收效率、操作簡(jiǎn)便程度及吸附劑用量，本發(fā)明最終選擇在線凈化技術(shù)，用3g中性氧化鋁作為吸附劑，作為同時(shí)凈化14種雙酚的方法；

40.3、通過(guò)優(yōu)化液相色譜柱、柱溫、流動(dòng)相種類及添加劑、流動(dòng)相洗脫梯度等超高效液相色譜

?

串聯(lián)質(zhì)譜儀的相關(guān)條件，同時(shí)綜合考慮回收效率及檢測(cè)時(shí)間成本，根據(jù)色譜峰保留時(shí)間、目標(biāo)物的特征離子以及其豐度比進(jìn)行定性，內(nèi)標(biāo)法定量，本發(fā)明最終僅在10min內(nèi)就能很好完成14種雙酚的分離。并且所有目標(biāo)物具備回收率高、檢出限低等特點(diǎn)，在該種類有機(jī)污染物的土壤介質(zhì)檢測(cè)領(lǐng)域具有重要意義。

41.與目前有機(jī)污染物的前處理和檢測(cè)方法相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和有益效果是：

42.14種雙酚均采用加速溶劑萃取方法同時(shí)萃取，期間進(jìn)行在線凈化除雜，得到的提取液經(jīng)減壓濃縮后用甲醇定容，最后用uplc

?

ms/ms定性定量分析。根據(jù)色譜峰保留時(shí)間、目標(biāo)物的特征離子以及其豐度比進(jìn)行定性，內(nèi)標(biāo)法定量。本方法所需提取劑較少、提取和凈化過(guò)程同步經(jīng)dionex ase 350系統(tǒng)完成并節(jié)約人力、前處理操作快捷、凈化效果顯著、僅

10min內(nèi)就能很好完成14種雙酚的分離。并且各目標(biāo)物具備回收率高、檢出限低等特點(diǎn)，在該種類有機(jī)污染物的土壤介質(zhì)檢測(cè)領(lǐng)域具有重要意義。

43.綜上所述，本發(fā)明通過(guò)優(yōu)化樣品萃取方法、萃取液凈化以及超高效液相色譜

?

串聯(lián)質(zhì)譜的定性定量分析條件等，建立了一種能同時(shí)提取、同時(shí)凈化和同時(shí)檢測(cè)土壤中bpa及其13種結(jié)構(gòu)類似物的方法，該方法節(jié)約時(shí)間、耗材、人力，綠色環(huán)保。

附圖說(shuō)明

44.下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。

45.圖1是加速溶劑萃取過(guò)程中不同種類提取劑對(duì)14種雙酚(雙酚a及其十三種結(jié)構(gòu)類似物)的回收影響；

46.每組中，從左至右依次為：1：乙醇；2：丙酮；3:乙酸乙酯；4：甲醇；5：甲醇/丙酮/水(45/45/10，v/v)+1％甲酸；6：甲醇/丙酮(50/50，v/v)；7：甲醇/丙酮(50/50，v/v)+1％甲酸。

47.圖2是在線凈化過(guò)程中不同吸附劑種類對(duì)14種雙酚的回收影響；

48.每組中，從左至右依次為：

[0049][0050]

圖3是在線凈化過(guò)程中不同中性氧化鋁含量對(duì)14種雙酚的回收影響；

[0051]

每組中，從左至右依次為：2g、3g、4g、5g。

[0052]

圖4是加速溶劑萃取過(guò)程中不同萃取溫度對(duì)14種雙酚的回收影響；

[0053]

每組中，從左至右依次為：80℃、100℃、120℃、150℃。

[0054]

圖5是加速溶劑萃取過(guò)程中不同萃取循環(huán)次數(shù)對(duì)14種雙酚的回收影響；

[0055]

每組中，從左至右依次為：2cycles、3cycles、4cycles、5cycles。

[0056]

圖6是14種雙酚的特征譜圖。

具體實(shí)施方式

[0057]

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此：

[0058]

實(shí)施例1：

[0059]

一、適用范圍

[0060]

本實(shí)施例中分析測(cè)試的14種雙酚為：雙酚a(bisphenol a，bpa)、雙酚p(bisphenol p，bpp)、雙酚m(bisphenol m，bpm)、雙酚af(bisphenol af，bpaf)、雙酚e(bisphenol e，bpe)、雙酚ph(bisphenol ph，bpph)、雙酚ap(bisphenol ap，bpap)、雙酚f(bisphenol f，bpf)、雙酚s(bisphenol s，bps)、雙酚b(bisphenol b，bpb)、雙酚fl(bisphenol fl，bpfl)、雙酚tmc(bisphenol tmc，bp

?

tmc)、雙酚bp(bisphenol bp，bpbp)、雙酚z(bisphenol z，bpz)。

[0061]

二、試劑及其配制

[0062]

除非另有說(shuō)明，分析時(shí)所使用的試劑均為符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的色譜級(jí)。實(shí)驗(yàn)用水是

mili

?

q超純水。

[0063]

乙醇(c2h6o)：色譜純；

[0064]

丙酮(c3h6o)：色譜純；

[0065]

乙酸乙酯(c4h8o2)：色譜純；

[0066]

甲醇(ch3oh)：色譜純；

[0067]

甲醇

?

丙酮

?

水酸性混合溶劑：先將甲醇、丙酮和水按45/45/10的體積比混合，然后加入上述混合液體積1％的甲酸作為添加劑；

[0068]

甲醇

?

丙酮混合溶劑：甲醇和丙酮按1/1的體積比混合；

[0069]

甲醇

?

丙酮酸性混合溶劑：甲醇和丙酮按1/1的體積比混合，然后加入上述混合液體積1％的甲酸作為添加劑；

[0070]

吸附劑硅膠、酸性/中性氧化鋁、florisil，加速溶劑萃取池填料硅藻土和石英砂均在馬弗爐中于450℃高溫灼燒10h，冷卻至室溫后備用。

[0071]

雙酚標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：100μg ml

?1(每種雙酚)，溶于甲醇，

?

20℃保存。

[0072]

雙酚標(biāo)準(zhǔn)中間溶液：準(zhǔn)確移取適量體積的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，用甲醇稀釋至所需濃度，

?

20℃保存。

[0073]

進(jìn)樣內(nèi)標(biāo)使用溶液：雙酚a

?

d6(bpa

?

d6)，100μg ml

?1，溶于甲醇，

?

20℃保存。

[0074]

進(jìn)樣內(nèi)標(biāo)中間溶液：準(zhǔn)確移取適量體積的進(jìn)樣內(nèi)標(biāo)使用溶液，用甲醇稀釋至所需濃度，

?

20℃保存。

[0075]

待測(cè)目標(biāo)雙酚混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：因?yàn)樵趯?shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)明顯的土壤基質(zhì)效應(yīng)，抑制了目標(biāo)物質(zhì)的相應(yīng)強(qiáng)度，故使用基質(zhì)標(biāo)線來(lái)對(duì)樣品進(jìn)行處理。按樣品前處理方式對(duì)空白土壤進(jìn)行前處理后得到1ml濃縮液，為基質(zhì)提取液；

[0076]

準(zhǔn)確稱取適量的雙酚標(biāo)準(zhǔn)中間溶液以及進(jìn)樣內(nèi)標(biāo)中間溶液溶于1ml的基質(zhì)提取液中制備成含14種雙酚混合濃度為1ng ml

?1、5ng ml

?1、10ng ml

?1、50ng ml

?1、100ng ml

?1、200ng ml

?1和含進(jìn)樣內(nèi)標(biāo)物濃度為50ng ml

?1的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，

?

20℃保存。

[0077]

三、儀器及設(shè)備

[0078]

超高效液相色譜

?

三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀(waters acquity uplc i

?

class/xevo tq

?

xs)；acquity beh phenyl色譜柱(2.1mm

×

100mm，1.7μm)；acquity beh c18色譜柱(2.1mm

×

50mm，1.7μm)；acquity beh c18色譜柱(2.1mm

×

100mm，1.7μm)；cortecs c18+色譜柱(2.1mm

×

100mm，1.6μm)；加速溶劑萃取儀(dionex ase 350)；heidolph旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器；數(shù)顯恒溫水浴鍋；mx

?

s渦旋混勻儀；立式冷凍干燥機(jī)；馬弗爐；thermo超速離心機(jī)；一般實(shí)驗(yàn)室常用儀器和設(shè)備。

[0079]

四、所述超高效液相色譜

?

串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定土壤中14種雙酚的方法包括如下步驟：

[0080]

1、樣品制備

[0081]

采集的土壤樣品置于棕色玻璃瓶中，玻璃瓶先用超純水洗凈，于馬弗爐中450℃灼燒10h以徹底去除玻璃瓶?jī)?nèi)殘留的有機(jī)物等；采集后的土壤樣品于4℃以下冷藏、避光、密封保存，盡快帶到實(shí)驗(yàn)室分析。

[0082]

將土壤樣品放在搪瓷盤上，混勻，除去枝棒、葉片、石子等異物，放于真空冷凍干燥機(jī)中干燥脫水(0.2mbar的真空度、

?

50℃，干燥5d，此時(shí)樣品的至含水率小于1％)；干燥后的

土壤過(guò)2mm篩，然后用研缽和研棒研磨至過(guò)100目篩的均勻粉末，置于琥珀色玻璃小瓶中保存在4℃條件下備用。

[0083]

2、樣品前處理

[0084]

因?yàn)槌Ｓ玫奶崛》椒ê笮枰?jīng)固相萃取柱進(jìn)行凈化除雜，該過(guò)程通常耗時(shí)耗力。因此在實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有條件下，本發(fā)明考慮使用加速溶劑萃取結(jié)合在線凈化技術(shù)對(duì)樣品進(jìn)行前處理操作。

[0085]

具體步驟為：在34ml的不銹鋼萃取池底部墊入cellulose ase萃取膜，從底部向上依次填入2g硅藻土，3g中性氧化鋁，空白土壤和硅藻土等質(zhì)量比的混合物，用量2g(防止土壤板結(jié))，加入混合標(biāo)樣(100ng g

?1)和氘代內(nèi)標(biāo)(100ng g

?1)，最后用石英砂鋪滿萃取池。因此，在萃取池中的填料為層層分明。

[0086]

用甲醇/丙酮(1/1，v/v)+1％甲酸作為加速溶劑萃取的提取劑，每個(gè)萃取池需要提取劑的量約為65ml；萃取過(guò)程(ase)在以下條件下運(yùn)行：每個(gè)循環(huán)為：100℃，1500psi平衡壓力，加熱時(shí)間5min，靜態(tài)提取時(shí)間5min；3個(gè)循環(huán)，漂洗量60％和吹掃時(shí)間100s。

[0087]

收集提取液，而后在50℃水浴下減壓蒸發(fā)濃縮至約0.5ml，用甲醇定容至1ml，作為濃縮液；

[0088]

將濃縮液轉(zhuǎn)移至2ml離心管中，放入thermo超速離心管中，在2500g速度下離心10min，取上清液放入waters自動(dòng)進(jìn)樣器樣品瓶中，以待后續(xù)分析。

[0089]

說(shuō)明：空白土壤是指選用的幾乎沒(méi)有受過(guò)農(nóng)膜覆蓋、農(nóng)藥噴灑等污染的土壤樣品。

[0090]

3、樣品測(cè)定

[0091]

(1)色譜條件為：

[0092]

色譜柱：acquity beh phenyl(2.1mm

×

100mm，1.7μm)；柱溫40℃；樣品進(jìn)樣量為5μl；

[0093]

在二元溶劑管理器前，使用較短的uplc色譜柱(acquity beh c18，2.1mm

×

50mm，1.7μm)作為捕集柱，捕集柱的作用是把流動(dòng)相中的可能含有的雙酚給捕集掉，從而消除儀器和流動(dòng)相中可能存在的本底干擾；

[0094]

流動(dòng)相：a相為超純水，b相為甲醇，二者均為hplc級(jí)，并且均加入了體積分?jǐn)?shù)0.1％的氨水作添加劑；流速為0.2ml min

?1；

[0095]

流動(dòng)相的洗脫梯度為：0

?

2min，40％b；2

?

3.5min，40％b

?

100％b；3.5

?

9min，維持100％b；9

?

9.1min，重新平衡至40％b；9.1

?

10min，維持40％b；

[0096]

(2)質(zhì)譜條件為：負(fù)電荷電噴霧離子源(esi

?

)；毛細(xì)管電壓為1.47kv；源溫度150℃；去溶劑氣溫度400℃；去溶劑氣流量為1000l h

?1；錐氣流量150l h

?1；碰撞氣體為0.15ml min

?1的氬氣；采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(mrm)進(jìn)行定量分析。14種雙酚物質(zhì)的定量標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)線性系數(shù)r2為0.9938～0.9998。

[0097]

五、記錄與計(jì)算

[0098]

1、14種雙酚的定性分析

[0099]

使用mrm模式(表1)。圖6為14種雙酚的特征離子譜圖。

[0100]

表1不同雙酚的母離子、定量/定性特征離子、錐孔電壓、碰撞能及保留時(shí)間

[0101][0102][0103]

2、14種雙酚的定量分析

[0104]

繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：因?yàn)樵趯?shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)明顯的土壤基質(zhì)效應(yīng)，抑制了目標(biāo)物質(zhì)的相應(yīng)強(qiáng)度，故使用基質(zhì)標(biāo)線來(lái)對(duì)樣品進(jìn)行處理。按樣品前處理方式對(duì)空白土壤進(jìn)行前處理后得到1ml濃縮液，為基質(zhì)提取液；

[0105]

準(zhǔn)確稱取適量的雙酚標(biāo)準(zhǔn)中間溶液以及進(jìn)樣內(nèi)標(biāo)中間溶液溶于1ml的基質(zhì)提取液中制備成含14種雙酚混合濃度為1ng ml

?1、5ng ml

?1、10ng ml

?1、50ng ml

?1、100ng ml

?1、200ng ml

?1和含進(jìn)樣內(nèi)標(biāo)物濃度為50ng ml

?1的6種雙酚濃度梯度混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液(其中進(jìn)樣內(nèi)標(biāo)濃度恒定)，

?

20℃保存。相關(guān)系數(shù)要達(dá)到0.99以上。

[0106]

樣品測(cè)定：用以上6種雙酚濃度梯度混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液(其中進(jìn)樣內(nèi)標(biāo)濃度恒定)

繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，該曲線的縱坐標(biāo)為目標(biāo)組分定量離子峰面積a

x

與進(jìn)樣內(nèi)標(biāo)的定量離子峰面積a

is

之比。橫坐標(biāo)為目標(biāo)組分的濃度c

x

與進(jìn)樣內(nèi)標(biāo)的濃度c

is

之比。由此求得相應(yīng)因子rf。

[0107][0108]

實(shí)際土壤樣品中在測(cè)定前加入相同濃度的進(jìn)樣內(nèi)標(biāo)，測(cè)得目標(biāo)物的定量離子峰面積a

x

后，分別計(jì)算土壤樣品中各目標(biāo)物的質(zhì)量濃度，計(jì)算公式如下：

[0109][0110]

式中：c

x

—實(shí)際土壤樣品中目標(biāo)物含量，mg kg

?1；

[0111]

a

x

—目標(biāo)物定量離子峰面積；

[0112]

q

is

—進(jìn)樣內(nèi)標(biāo)量，μg；

[0113]

a

is

—進(jìn)樣內(nèi)標(biāo)定量離子峰面積；

[0114]

rf—相應(yīng)因子；

[0115]

m—土壤樣品的稱取量，g；

[0116]

100％—樣品干物質(zhì)量，％；

[0117]

六、方法學(xué)驗(yàn)證

[0118]

1、標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和定量限

[0119]

分別配制1ng ml

?1、5ng ml

?1、10ng ml

?1、50ng ml

?1、100ng ml

?1、200ng ml

?1的濃度梯度的14種雙酚的標(biāo)準(zhǔn)混合樣品溶液(樣品中，內(nèi)標(biāo)的濃度為50ng ml

?1)，按照uplc

?

ms/ms條件，從低濃度到高濃度依次進(jìn)樣分析。以目標(biāo)組分的濃度與進(jìn)樣內(nèi)標(biāo)的濃度比為橫坐標(biāo)，以目標(biāo)組分定量離子峰面積與進(jìn)樣內(nèi)標(biāo)的定量離子峰面積比作為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示：14種雙酚化合物的相關(guān)系數(shù)均大于0.9938(0.9938～0.9998)，線性關(guān)系良好；

[0120]

方法開發(fā)的土壤本底值經(jīng)測(cè)定很低，幾乎可以忽略。在土壤中加入14種雙酚以及內(nèi)標(biāo)的混合標(biāo)準(zhǔn)中間樣，配制成20ng g

?1的標(biāo)準(zhǔn)樣品(內(nèi)標(biāo)濃度為100ng g

?1)；

[0121]

按照上述步驟四、步驟五進(jìn)行檢測(cè)，連續(xù)分析7次上述低濃度的土壤空白加標(biāo)樣品，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差s。儀器檢出限(instrument detection limit，idl)定義為信噪比增加3倍時(shí)的濃度，方法檢出限(method detection limit，mdl)根據(jù)美國(guó)epasw

?

846中規(guī)定方法mdl＝s*t(n

?

1,0.99)計(jì)算方法檢出限，其中公式中t(n

?

1,0.99)指置信度為99％、自由度為n

?

1時(shí)的t值，此處為3.143；n為平行分析樣品數(shù)，此處為7。方法定量(method quantification limit，mql)限規(guī)定為標(biāo)準(zhǔn)偏差s的10倍。具體結(jié)果見表2，雙酚的檢出限范圍為1.25

?

3.41ng g

?1，定量下限在3.99

?

10.85ng g

?1之間。

[0122]

表2不同雙酚的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限(n＝7)

[0123][0124][0125]

2、精密度與準(zhǔn)確度

[0126]

土壤采自浙江省杭州市，采集的土壤樣品與冰袋一同置于保溫箱中運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，如上述步驟四.1所述，除去土壤中植物組織及石塊等異物，將土樣混合均勻，干燥，然后用研缽和研棒研磨至過(guò)100目篩的均勻粉末，置于琥珀色玻璃小瓶中保存在4℃條件下備用。

[0127]

土壤基本理化性質(zhì)依據(jù)《土壤農(nóng)化分析》進(jìn)行分析：土壤機(jī)械組成為砂粒、粉粒和黏粒，質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為63.0％、26.5％和10.5％，有機(jī)質(zhì)含量為13.30g kg

?1，總氮含量為1.08g kg

?1，總磷含量為1.74g kg

?1，ph為5.80；不含表1所述的14種雙酚。

[0128]

分別向1g潔凈土樣中加入適量的14種雙酚以及內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，進(jìn)行加標(biāo)回收率測(cè)定(即，按照上述步驟四的2～3、步驟五進(jìn)行檢測(cè))。加標(biāo)濃度梯度分別為20、100、200ng g

?1，內(nèi)標(biāo)濃度為100ng g

?1，每個(gè)濃度水平做3次平行。

[0129]

以上3個(gè)濃度梯度土壤加標(biāo)回收試驗(yàn)中，雙酚的回收率范圍分別為80.33％

?

118.67％、79.53％

?

114.27％和80.20％

?

115.80％；標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍分別為3.46％

?

8.72％、0.20％

?

5.98％、0.31％

?

4.61％。詳見表3。

[0130]

表3低中高三個(gè)濃度下不同雙酚的回收率及標(biāo)準(zhǔn)偏差(n＝3)

[0131][0132][0133]

3、方法重復(fù)性

[0134]

此外，對(duì)上述三個(gè)濃度進(jìn)行了日內(nèi)和日間重復(fù)實(shí)驗(yàn)，比較了日內(nèi)和日間的差異，評(píng)估方法的重復(fù)性。日內(nèi)實(shí)驗(yàn)為在一天中早中晚三個(gè)時(shí)間段對(duì)上述三個(gè)濃度的樣品進(jìn)行分析，日間實(shí)驗(yàn)是在第1、3、7三天的同一時(shí)間段進(jìn)行三個(gè)濃度的分析比較；

[0135]

如表4所示，日內(nèi)回收率標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10％，日間小于11％，顯示出優(yōu)異的可重復(fù)性。

[0136]

表4低中高三個(gè)濃度下不同雙酚回收率的日內(nèi)和日間差異(n＝3)

[0137][0138][0139]

因此，該發(fā)明能實(shí)現(xiàn)對(duì)土壤中雙酚a及其13種結(jié)構(gòu)類似物的同時(shí)萃取、同時(shí)凈化、同時(shí)檢測(cè)分析。并且本方法所需提取溶劑少、前處理操作快捷、凈化效果顯著、僅在10min內(nèi)就能很好完成14種物質(zhì)的分離并且各目標(biāo)物具備回收率高、檢出限低等特點(diǎn)，節(jié)約了時(shí)間和經(jīng)濟(jì)成本，在該種類有機(jī)污染物的土壤介質(zhì)檢測(cè)領(lǐng)域具有重要意義。

[0140]

對(duì)比例1、將實(shí)施例1樣品前處理中的加速溶劑由“甲醇/丙酮(1/1，v/v)+1％甲酸”分別改成“乙醇”、“丙酮”、“乙酸乙酯”、“甲醇”、“甲醇/丙酮/水(45/45/10，v/v)+1％甲酸”、“甲醇/丙酮(1/1，v/v)”，其余等同于實(shí)施例1。

[0141]

所得結(jié)果如圖1所述：不同提取劑對(duì)雙酚回收率影響顯著。對(duì)于bps，只有提取劑為甲醇/丙酮(1/1，v/v)+1％甲酸時(shí)，才能滿足回收率在80％

?

120％的標(biāo)準(zhǔn)。并且該提取劑對(duì)于其他13種雙酚的回收率均能滿足該標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)于其余6種提取劑，均存在回收率偏低(小于80％)或偏高(大于120％)的情況，因此選擇甲醇/丙酮(1/1,v/v)+1％甲酸作為ase過(guò)程的提取劑。

[0142]

對(duì)比例2、將實(shí)施例1樣品前處理中的作為吸附劑的“中性氧化鋁”改成“酸性氧化鋁”、“硅膠”、“florisil”、“c18”，其余等同于實(shí)施例1。

[0143]

所得結(jié)果如圖2所述：當(dāng)酸性氧化鋁作吸附劑時(shí)，14種雙酚的回收率范圍為81％

?

149％(其中bpaf為149％)；中性氧化鋁作吸附劑時(shí)，回收率在83％

?

115％；硅膠作吸附劑時(shí)，回收率在76％

?

116％(其中bpz,bpfl,bpph回收率為76％)；florisil作吸附劑時(shí)，回收率為43％

?

166％(其中bpph為43％，bpaf為132％，bpz為74％，bps為166％)；c18作吸附劑時(shí)，回收率為70％

?

147％(其中bpph為70％,bpaf為140％,bps為147％)。因此可得只有中性氧化鋁作吸附劑時(shí)，可以滿足所有雙酚的回收率均符合80％

?

120％的標(biāo)準(zhǔn)。萃取池中填充的吸附劑用于吸附土壤中除目標(biāo)分析物之外的其他雜質(zhì)，適量的吸附劑需要滿足盡可能吸附雜質(zhì)的同時(shí)又不吸附目標(biāo)物質(zhì)，使得目標(biāo)物有較高的回收率。因此，選擇中性氧化鋁作為在線凈化的吸附劑。

[0144]

對(duì)比例3、將實(shí)施例1樣品前處理中的作為吸附劑的“3g中性氧化鋁”改成“2g”、“4g”、“5g”，其余等同于實(shí)施例1。

[0145]

所得結(jié)果如圖3所述：比較了不同量的中性氧化鋁作吸附劑時(shí)，各雙酚的回收率情況，發(fā)現(xiàn)吸附劑的含量對(duì)雙酚回收率的影響不顯著，所有情況下均滿足了回收率在80％

?

120％的標(biāo)準(zhǔn)，且差別不大。當(dāng)吸附劑量為3g時(shí)，13種物質(zhì)(除了bpf)的回收率較2g吸附劑時(shí)有增大；吸附劑量為4g時(shí)，較3g的情況，8種物質(zhì)(bpe，bpb，bps，bpz，bp

?

tmc，bpm，bpp，bpph)的回收率降低了；量為5g時(shí)，11種物質(zhì)(bpa，bpb，bps，bpz，bpap，bp

?

tmc，bpaf，bpm，bpp，bpbp，bpph)的回收率有所降低。結(jié)合綠色化學(xué)理念，使用3g的中性氧化鋁既能確保最好的回收率情況，又節(jié)約耗材，產(chǎn)生更少的實(shí)驗(yàn)有機(jī)廢物。因此選擇3g的中性氧化鋁作為在線凈化的吸附劑。

[0146]

對(duì)比例4、將實(shí)施例1樣品前處理中的加速溶劑萃取溫度由100℃改成80℃、120℃、150℃，其余等同于實(shí)施例1。

[0147]

所得結(jié)果如圖4所述，除了bpf，bpe，bpfl三種物質(zhì)外，100℃下的目標(biāo)物質(zhì)的回收率均優(yōu)于80℃下的；而當(dāng)溫度升高時(shí)，除了bpf，bpe，bpp的回收率略有升高外，其余11種物質(zhì)的回收率反而降低了；當(dāng)溫度達(dá)到150℃時(shí)，絕大多數(shù)物質(zhì)的回收率有了較明顯的降低(bpf，bpe，bpa除外)，特別的，bps的回收率只有55％，bpaf只有76％，bpph只有67％，均低于標(biāo)準(zhǔn)的80％。綜上，100℃是雙酚ase的最適溫度，回收率最優(yōu)化的同時(shí)能節(jié)約萃取的時(shí)間。故選擇100℃作為ase的提取溫度。

[0148]

對(duì)比例5、將實(shí)施例1樣品前處理中的加速溶劑萃取循環(huán)次數(shù)由3次改成2次、4次、5次，其余等同于實(shí)施例1。

[0149]

所得結(jié)果如圖5所述，比較了不同的提取循環(huán)次數(shù)對(duì)最終雙酚的回收率的影響，一般來(lái)說(shuō)，ase萃取的循環(huán)次數(shù)越多，物質(zhì)的回收率越高。本實(shí)驗(yàn)中的結(jié)果也基本滿足這一規(guī)律。循環(huán)次數(shù)為3時(shí)，較次數(shù)為2時(shí)，有13種物質(zhì)的回收率增高(bpa除外)，但是當(dāng)循環(huán)提取4次時(shí)，bpm和bpfl的回收率略超出了標(biāo)準(zhǔn)值120％，分別達(dá)到了124％和131％。次數(shù)進(jìn)一步增加到5次時(shí)，有7種物質(zhì)的回收率高于標(biāo)準(zhǔn)值(bps為121％，bpap為125％，bpaf為131％，bpm為126％，bpp為127％，bpfl為140％，bpbp為127％)。因此，認(rèn)為循環(huán)次數(shù)為3次是最優(yōu)的。

[0150]

實(shí)驗(yàn)1、取消“2、樣品前處理”中的“加入混合標(biāo)樣(100ng g

?1)”，其余等同于實(shí)施例1。

[0151]

將實(shí)際待測(cè)的以下土壤樣品(從污染嚴(yán)重地取樣所得)按照上述方法進(jìn)行檢測(cè)，所得結(jié)果如表5所示。

[0152]

表5實(shí)際土樣中雙酚污染情況(ng g

?1d.w.)

[0153][0154]

nd：未檢測(cè)到；

a

：低于方法定量限。

[0155]

與目前已有的環(huán)境固體介質(zhì)中雙酚分析方法進(jìn)行比較(表6)，可見本發(fā)明中提到的方法具有更低的方法檢出限、方法定量限，以及更高的回收率，具有更好的靈敏度、精密度和可重復(fù)性。

[0156]

表6現(xiàn)有方法與本發(fā)明方法的性能比較

[0157][0158]

a

：未提及。

[0159]

[1]y.yang,l.lu,j.zhang,y.yang,y.wu,b.shao,simultaneous determination of seven bisphenols in environmental water and solid samples by liquid chromatography

?

electrospray tandem mass spectrometry,j chromatogr a 1328(2014)26

?

34.

[0160]

[2]z.huang,j.l.zhao,y.y.yang,y.w.jia,q.q.zhang,c.e.chen,y.s.liu,b.yang,l.xie,g.g.ying,occurrence,mass loads and risks of bisphenol analogues in the pearl river delta region,south china:urban rainfall runoff as a potential source for receiving rivers,environ pollut 263(pt b)(2020)114361.

[0161]

[3]x.yu,j.xue,h.yao,q.wu,a.k.venkatesan,r.u.halden,k.kannan,occurrence and estrogenic potency of eight bisphenol analogs in sewage sludge from the u.s.epa targeted national sewage sludge survey,j hazard mater 299(2015)733

?

9.

[0162]

最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的若干個(gè)具體實(shí)施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實(shí)施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。技術(shù)特征：

1.土壤中雙酚a及其十三種結(jié)構(gòu)類似物的同步測(cè)定方法，其特征包括如下步驟：(1)樣品制備：將土壤樣品除雜混勻后進(jìn)行干燥脫水，過(guò)篩，備用；(2)樣品提取及凈化：2.1)、稱取1克步驟(1)所得的土壤進(jìn)行加速溶劑萃取，凈化，得到提取液；2.2)、將提取液濃縮至0.5

±

0.1ml，并用甲醇定容至1

±

0.1ml，得濃縮液；2.3)、對(duì)濃縮液進(jìn)行離心除雜，收集上清液；(3)樣品檢測(cè)：將上清液中的土壤中雙酚a及其十三種結(jié)構(gòu)類似物用超高效液相色譜

?

串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行定性定量分析。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的土壤中雙酚a及其十三種結(jié)構(gòu)類似物的同步測(cè)定方法，其特征是：所述步驟2.1)中：加速溶劑萃取過(guò)程中使用萃取池，在其底部墊入cellulose ase萃取膜，從底部向上依次填入2g硅藻土，3g中性氧化鋁，空白土壤和硅藻土等質(zhì)量比的混合物2g，加入混合標(biāo)樣(100ng g

?1)和氘代內(nèi)標(biāo)(100ng g

?1)，最后用石英砂鋪滿萃取池；用甲醇

?

丙酮酸性混合溶劑作提取劑，萃取過(guò)程在以下條件下運(yùn)行：80

?

150℃，1500psi平衡壓力，加熱時(shí)間5

?

7min，靜態(tài)提取時(shí)間5min，2

?

5個(gè)循環(huán)，漂洗量60％和吹掃時(shí)間100s；甲醇

?

丙酮酸性混合溶劑為甲醇和丙酮按1/1的體積比混合，然后加入上述混合液體積1％的甲酸作為添加劑。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的土壤中雙酚a及其十三種結(jié)構(gòu)類似物的同步測(cè)定方法，其特征是：所述步驟2.2)中，濃縮方法為減壓旋蒸濃縮，將加速溶劑萃取后收集到的提取液在heidolph旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中55℃的水浴中減壓旋蒸濃縮至0.5

±

0.1ml，然后用甲醇定容至1

±

0.1ml。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的土壤中雙酚a及其十三種結(jié)構(gòu)類似物的同步測(cè)定方法，其特征是：所述步驟2.3)中，將濃縮液倒入2ml離心管中，在超速離心機(jī)中以2500g的速度離心10min后，取上清液。5.根據(jù)權(quán)利要求1～4任一所述的土壤中雙酚a及其十三種結(jié)構(gòu)類似物的同步測(cè)定方法，其特征是：液相色譜的條件為：液相色譜柱：acquity beh phenyl；柱溫40℃；流動(dòng)相：a相為在超純水中加入占超純水體積0.1％的氨水，b相為在甲醇中加入占甲醇體積0.1％的氨水；流速為0.2ml min

?1；流動(dòng)相的洗脫梯度為：0

?

2min，40％b；2

?

3.5min，40％b

?

100％b；3.5

?

9min，維持100％b；9

?

9.1min，重新平衡至40％b；9.1

?

10min，維持40％b；樣品進(jìn)樣量為5μl；質(zhì)譜條件為：負(fù)電荷電噴霧離子源；毛細(xì)管電壓為1.47kv；源溫度150℃；去溶劑氣溫度400℃；去溶劑氣流量為1000l h

?1；錐氣流量150l h

?1；碰撞氣體為0.15ml min

?1的氬氣；采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式進(jìn)行定量分析。

6.根據(jù)權(quán)利要求1～5任一所述的土壤中雙酚a及其十三種結(jié)構(gòu)類似物的同步測(cè)定方法，其特征是：所述步驟(1)中的干燥為冷凍干燥。

技術(shù)總結(jié)

本發(fā)明公開了一種土壤中雙酚A及其十三種結(jié)構(gòu)類似物的同步測(cè)定方法，包括如下步驟：將土壤樣品除雜混勻后進(jìn)行干燥脫水，過(guò)篩，備用；樣品提取及凈化，收集上清液；將上清液中的土壤中雙酚A及其十三種結(jié)構(gòu)類似物用超高效液相色譜

技術(shù)研發(fā)人員：呂志江 徐逸文 何艷 徐建明

受保護(hù)的技術(shù)使用者：浙江大學(xué)

技術(shù)研發(fā)日：2020.12.16

技術(shù)公布日：2021/4/26